Azoindoxylverfahren zum Hydrolasennachweis

Summary

Using fresh frozen, freeze-dried or cryostate sections from aldehyde fixed rat tissues 13 diazonium salts were tested as simultaneous coupling reagents for the localization of acid, neutral and alkaline hydrolases with azo indoxyl methods. Hexazotized new fuchsine and/or Fast blue B are the diazonium salts of choice for the demonstration of acid β-galactosidase, neuraminidase, β-N-acetylglucosaminidase, acid phosphatase, and non-specific esterase followed by hexazotized p-rosaniline. Fast blue VB, BB and RR and Fast violet B are recommended for the investigation of alkaline phosphatase and lactase, Fast garnet GBC for acid β-galactosidase, glucosaminidase and lactase. Fast red B, RC, RL and TR and Fast black K can only be employed for lactase studies. The exact concentration of the coupling reagent depends on the activity of the enzyme and the organ investigated. On the average 0.01–0.02 ml unstable diazonium salt/ml and 0.3–1 mg stable diazonium salt/ml are sufficient for the correct localization of these hydrolases. Freeze-dried cryostat sections yield the best results in the demonstration of lactase and alkaline phosphatase independent on the coupling reagent used. Sections from formaldehyde or glutaraldehyde fixed organs are superior for the localization of the other hydrolases; an exception is the investigation of acid β-galactosidase and glucosaminidase with Fast garnet GBC. Then, excellent results are obtained also with freeze-dried material.

Fresh frozen sections are suitable for the localization of lactase with hexazotized new fuchsine or p-rosaniline and of alkaline phosphatase with Fast blue VB and BB or violet B. The total activity of acid, neutral and alkaline hydrolases can be investigated using semipermeable membranes in combination with all unstable and stable diazonium salts of choice.

Reliable osmification of the azoindoxyl dye is only possible if hexazotized p-rosaniline is employed for coupling; without further posttreatment all azoindoxyl dyes are extracted by ethanol, isopropanol or xylol.

7 incubation media are given for the demonstration of hydrolases with azoindoxyl methods at the level of light microscopy for routine studies and typical examples for the application of these methods are presented. A modified procedure is described for the freeze-drying of cryostat sections with the Edwards-Pearse tissue dryer EPD 3.

Zusammenfassung

An frischen, gefriergetrockneten und Schnitten von aldehyd-fixierten Rattengeweben werden 13 Diazoniumsalze als Simultankuppler zum Nachweis saurer, neutraler und alkalischer Hydrolasen mit Azoindoxylverfahren geprüft. Hexazotiertes Neufuchsin und/oder Fast Blue B sind die Diazoniumsalze der Wahl zur Lokalisation von saurer β-Galactosidase, Neuraminidase, β-N-Acetylglucosaminidase, saurer Phosphatase und unspezifischer Esterase gefolgt von Hexazonium-p-rosanilin. Fast Blue VB, BB und RR sowie Fast Violet B eignen sich zur Untersuchung von Lactase und alkalischer Phosphatase; Fast Garnet GBC kann zur Lokalisation von saurer β-Galactosidase, Glucosaminidase und Lactase, Fast Red B, RC, RL und TR sowie Black K nur für Lactase-Studien verwandt werden. Durchschnittlich reichen 0,01–0,02 ml instabiles Diazoniumsalz und 0,3–1 mg stabiles Diazoniumsalz/ml zur korrekten Lokalisation dieser Hydrolasen aus. Im einzelnen hängt die Kupplerkonzentration von der Enzymaktivität und vom untersuchten Organ ab. Gefriergetrocknete Kryostatschnitte liefern unabhängig vom Kuppler die besten Resultate bei Untersuchung von Lactase und alkalischer Phosphatase; Schnitte von form- oder glutaraldehyd-fixierten Organen sind beim Nachweis der restlichen Hydrolasen überlegen. Eine Ausnahme macht die Untersuchung der sauren β-Galactosidase und Glucosaminidase mit Fast Garnet GBC; dann werden die besten Ergebnisse nach Gefriertrocknung erzielt.

Frische Kryostatschnitte sind zur Darstellung der Lactase mit hexazotiertem Neufuchsin oder p-Rosanilin und der alkalischen Phosphatase mit Fast Blue VB und BB sowie Violet B geeignet; die Gesamtaktivität der sauren, neutralen und alkalischen Hydrolasen kann mit semipermeablen Membranen und den stabilen sowie instabilen Diazoniumsalzen der Wahl untersucht werden.

Ausreichende Osmierung der Azoindoxylfarbstoffe ist nur möglich, wenn Hexazonium-p-rosanilin als Kupplungsreagens benutzt wird; ohne Vorbehandlung extrahieren Äthanol, Isopropanol und Xylol alle Azoindoxyle.

7 Inkubationsmedien werden zum lichtmikroskopisch-histochemischen Nachweis von Glykosidasen, Esterasen und Phosphatasen mit Azoindoxylmethoden angegeben und typische Anwendungsbeispiele genannt. Zur Gefriertrocknung von Kryostatschnitten mit dem Edwards-Pearse Gewebetrockner EPD 3 wird ein modifiziertes Verfahren beschrieben.