The application of TMV particles as an internal magnification standard for determining virus particle sizes with the electron microscope

Abstract

At various sites on three grids with crude-sap preparations of tobacco mosaic virus (TMV), electron micrographs were made and per photograph 50–200 particles were measured. Calculated average lengths turned out to differ up to 4% according to the site photographed. Calculated lengths appeared to depend on potentiometer settings required for focussing. This is due to the effect of preparation height or object position along the optical axis of the electron microscope on image magnification. This is further supported by the effect of additional rings underneath the grid and of artificial bending of the grid. Because it is hard to reproduce exactly electron microscope magnification, and at given potentiometer settings per photograph calculated average lengths may still vary up to c. 4%, the application of internal standards is essential for determining the size of unknown viruses. With TMV only relative particle sizes can be determined, and even with more accurate non-biological standards no absolute virus sizes will be found.

Samenvatting

Met het toenemen van het aantal ontdekte virussen, ook binnen de morfologische groepen, neemt de behoefte toe om met de elektronenmicroscoop (e. m.) kleine verschillen te kunnen vaststellen en daartoe virusdeeltjes nauwkeurig te kunnen meten. Er bestaat echter in de literatuur zelfs nog veel onenigheid over de preciese lengte van goedbestudeerde virussen.

Door het verrichten van metingen aan grote aantallen tabaksmozaïekvirus(TMV)-deeltjes, gefotografeerd op talrijke plekken in drie verschillende ruw-sap-preparaten, belken de per opname voor 50–200 deeltjes berekende gemiddelde lengten aanzienlijk (max. ruim 4%) uiteen te lopen, al naar gefotografeerde plaats (Fig. 1). De berekende lengten (Fig. 2, verticale as) bleken afhankelijk te zijn van de voor scherpstelling van het beeld nodige potentiometerstanden der e.m. (Fig. 2, horizontale as). Deze instelling is een maat voor de hoogte van de betrokken plek van het preparaat, zoals duidelijk werd gedemonstreerd door onder het preparaat extra ringen te plaatsen (Fig. 2, rechtsboven) en ook door het preparaat benedenwaarts in te deuken (Fig. 2, linksonder).

Daar door de invloed van vele variabele factoren de vergroting van een e.m. moeilijk reproduceerbaar is (zie het niet samenvallen der lijnen A, B en C in Fig. 2), is het niet mogelijk uit te gaan van een eenvoudige ijkkromme. Bovendien bleken per scherpstelling de per foto gemeten gemiddelden nog sterk te kunnen verschillen. Het is daarom gewenst, maar ook heel eenvoudig, om aan een te meten viruspreparaat een interne standaard, bijv. TMV, toe te voegen, die bij elke opname dient te worden meegefotografeerd. Moeten bij lage concentraties van een te meten virus, zoals meestal bij ruw-sap-preparaten van virus uit de aardappelvirus-Y-groep het geval is, de resultaten van een aantal foto's worden gesommeerd, dan mag hiertoe pas worden overgegaan voor zover de toppen der meetkrommen van het standaardvirus in elkaars verlengde liggen.

Wel moet men er zich echter van bewust zijn dat op deze wijze slechts relatieve virusafmetingen worden bepaald. Daar de werkelijk gemeten afmetingen steeds duidelijker van verschillende omstandigheden afhankelijk blijken te zijn, wordt ook duidelijker dat ondanks groter meetnauwkeurigheid toch geen absolute waarden voor de deeltjesgrootten van virussen zullen kunnen worden bepaald.