Zur Bindung von Cyclophosphamid und Cyclophosphamid-Metaboliten an Serum-Albumin

Summary

Cyclophosphamide and some of its major metabolites were dialyzed against bovine-serum-albumin and human-blood-serum until equilibrium. From Scatchard plots the strength and stoechiometry of protein-binding were determined.

Cyclophosphamide, carboxyphosphamide and 4-ketocyclophosphamide were found to be bound only weakly and without specific binding sites.

N-mustard-diamido-phosphoric-acid is bound to serum-albumin with 1,5 binding sites per protein molecule. The binding is strongly pH-dependend. The binding constant obtained from the Scatchard plot is 3.2×10⁴ l/mol at 4° C and pH 7. No alkylation of the protein occured under the conditions of equilibrium dialysis but a strong reduction of the alkylating activity of N-mustard-diamido-phosphoric-acid was found to result from protein-binding. 4-hydroxycyclophosphamide was bound to albumin, both, by specific reaction with free thiol-groups of the protein and by unspecific weak absorption. The specific binding is based on substitution of the activated oxazaphosphorin ring by free thiol-groups of the protein forming a thio-glycosid-like protein derivate. A binding constant of 2×10⁴ l/mol at 4° C, pH 7 was determined. The reversibility of the reaction was proven by exchange of albumin-bound unlabelled 4-hydroxycyclophosphamide by tritiated 4-hydroxy-cyclophosphamide. A strong stabilisation of 4-hydroxycyclophosphamide and decrease in alkylating activity was found to result from protein-binding.

In human-blood-serum only 4-hydroxycyclophosphamide and N-mustard-diamido-phosphoric-acid showed a specific binding to protein. Free and protein-bound cyclophosphamide and metabolites could be separated by charcoal absorption. It could be demonstrated that 48 h after cyclophosphamide-injection blood-serum contained significant levels of protein-bound cyclophosphamide metabolites.

Zusammenfassung

Cyclophosphamid und Metabolite des Cyclophosphamid wurden der Gleichgewichtsdialyse mit Rinderserumalbumin und menschlichem Blutserum unterworfen. Durch Auswertung nach Scatchard wurden Bindungsfestigkeit und Bindungsstöchiometrie ermittelt.

Cyclophosphamid selbst, sowie seine Entgiftungsprodukte Carboxyphosphamid und 4-Ketocyclophosphamid wurden nur schwach und ohne spezifische Bindungsstellen durch Absorption an Protein gebunden.

N-Lost-Phosphorsäurediamid bindet sich im Verhältnis 1,5∶1 an Rinderserumalbumin. Die Bindung ist reversibel und stark pH-abhängig. Die Assoziationskonstante beträgt 3,2×10⁴ l/Mol bei 4° C und pH 7. Eine Alkylierung des Proteins wurde unter den angewandten Versuchsbedingungen ausgeschlossen, vielmehr tritt als Folge der Protein-Bindung eine Verminderung der alkylierenden Aktivität von N-Lost-Phosphorsäurediamid ein.

4-Hydroxycyclophosphamid, der primäre Metabolit des Cyclophosphamid wird neben einer unspezifischen schwachen Absorption reversibel an freie SH-Gruppen des Albumins gebunden. Die Assoziationskonstante beträgt 2×10⁴ l/Mol bei 4° C, pH 7. Auch hier ist eine Alkylierung des Proteins ausgeschlossen, vielmehr handelt es sich um eine Thioglycosid-artige Substitution des aktivierten Oxazaphosphorinrings durch die freien Thiol-Gruppen des Proteins. Die Gleichgewichtsnatur der Reaktion wurde durch Austauschversuche nachgewiesen. Die Protein-Bindung bewirkt eine Inaktivierung des 4-Hydroxycyclophosphamid mit verlangsamter Giftung (Alkylans-Freisetzung). Im menschlichen Blutserum ist die Bindung von Cyclophosphamid und Metaboliten an Proteine qualitativ vergleichbar mit der Bindung an Rinderserumalbumin; eine spezifische und stöchiometrische Bindung erfolgt nur mit 4-Hydroxycyclophosphamid und N-Lost-Phosphorsäurediamid.

Durch Absorption an Aktivkohle kann freies 4-Hydroxycyclophosphamid von Protein-gebundenem abgetrennt werden. Nach Injektion von Cyclophosphamid lassen sich im Blutserum der Ratte noch nach 48 Std Protein-gebundene Cyclophosphamid-Metabolite nachweisen.