Studies of the mechanism of biological calcification

Abstract

Ultrastructural changes duringin vitro calcification of a collagen-containing matrix derived from beef tendon were correlated with the time of calcification and with the effect of calcification inhibitors. The early stage of calcification is characterized by a molar Ca/P ratio of 1.0–1.2 and by the formation of intrafibrillar electron dense particles. These particles were 50 to 100 Å in diameter and produced no sharp fringes when examined by selected area electron diffraction. During later stages, the electron dense particles appear to coalesce and serve as centers for the growth of hydroxyapatite crystals. At concentration that inhibit hydroxyapatite formation, methylenediphosphonate allows uptake of a small amount of Ca²⁺ and HPO₄ ²⁻ with a molar Ca/P of 1.0–1.2 and the formation of the non-crystalline electron dense particles but prevents subsequent growth of hydroxyapatite. Phosphonoacetate depresses Ca²⁺ and HPO₄ ²⁻ uptake further and prevents formation of both noncrystalline and crystalline mineral. These findings are consistent with the multistep model of matrix calcification proposed earlier and indicate that the formation of a non-crystalline precursor of hydroxyapatite is induced by the matrix from a soluble phase that is comparable to physiological fluids.

Résumé

Les modifications ultrastructurales au cours de calcificationin vitro d’une matrice de tendon de boeuf, contenant du collagène, sont étudiées en fonction du temps de calcification et de l’efficacité d’inhibiteurs de la calcification. Le stade initial de la calcification est caractérisé par un rapport molaire Ca/P de 1,0–1,2 et par la formation de particules intrafibrillaires, denses aux électrons. Ces particules, de 50 à 100 Å de diamètre, ne donnent pas de raies nettes par diffraction électronique. A des stades plus tardifs, les particules denses aux électrons semblent confluer et servent de centres de croissance aux cristaux d’hydroxyleapatite. A des concentrations qui inhibent la croissance des cristaux d’hydroxyleapatite, le méthylène-diphosphonate permet l’incorporation de faibles quantités de Ca²⁺ et de HPO₄ ²⁻, avec un rapport molaire Ca/P de 1,0–1,2, et la formation de particules non-cristallines, opaques aux électrons. Il empêche, cependant, la croissance ultérieure d’hydroxyleapatite. Le phosphonoacétate diminue encore l’incorporation du Ca²⁺ et HPO₄ ²⁻ et empêche la formation du minéral cristallin et non-cristallin. Ces résultats confirment le modèle en plusieurs étapes de la calcification de la matrice et indiquent que la formation d’un précurseur non-cristallin d’hydroxyleapatite est induite par la matrice à partir d’une phase soluble comparable aux liquides physiologiques.

Zusammenfassung

Ultrastrukturelle Veränderungen während der in vitro-Verkalkung einer Collagen enthaltenden Matrix aus Rindersehne wurden mit der Verkalkungszeit und mit der Wirkung von Verkalkungshemmern in Beziehung gebracht. Die frühe Phase der Verkalkung wird charakterisiert durch ein molares Ca/P-Verhältnis von 1,0–1,2 und durch die Bildung von intrafibrillären elektronendichten Partikeln. Diese Partikel hatten einen Durchmesser von 50–100 Å und zeigten keine scharfen Ränder bei der Untersuchung von ausgewählten Zonen mittels Elektronendiffraktion. In späteren Phasen scheinen die elektronendichten Partikel zur verschmelzen und als Zentren für das Wachstum von Hydroxyapatitkristallen zu dienen. Methylendiphosphonat in Konzentrationen, welche die Bildung von Hydroxyapatit hemmen, ermöglicht die Aufnahme einer kleinen Menge von Ca²⁺ und HPO₄ ²⁻ mit einem molaren Ca/P von 1,0–1,2 und die Bildung der nicht-kristallinen elektronendichten Partikel, die Aufnahme von Ca²⁺ und HPO₄ ²⁻ noch weiter herab und verhindert die Bildung von nichtkristallinem und kristallinem Mineral. Diese Befunde stimmen mit dem früher vorgeschlagenen Multistufenmodell der Matrix-Verkalkung überein und deuten darauf hin, daß die Bildung eines nicht-kristallinen Vorläufers von Hydroxyapatit durch die Matrix aus einer löslichen Phase hervorgerufen wird, welche mit physiologischen Flüssigkeiten vergleichbar ist.