Vorbemerkungen

Auch für Leberpathologen, die auf dem Gebiet kindlicher Lebererkrankungen spezialisiert sind, stellt die Interpretation der Leberhistologie von jungen Patienten (JP) oftmals eine Herausforderung dar. Vor allem zwei Aspekte können Probleme bereiten: Einerseits steht eine Fülle von ätiologischen Faktoren, die durch die laufende Charakterisierung bislang unbekannter ontogenetischer Ursachen noch verstärkt wird, einem relativ engen Spektrum morphologischer Veränderungen der Leber gegenüber. Andererseits müssen bei JP Veränderungen der Läppchenarchitektur und zytologische, histochemische sowie immunhistochemische Befunde strikt in Zusammenhang mit dem Lebensalter interpretiert werden. Morphologische Befunde müssen mit dem regelrechten Entwicklungszustand der Leber von Feten, unreifen und termingeborenen Neugeborenen, Säuglingen, Kleinkindern, Kindern und Jugendlichen verglichen und entsprechend bewertet werden. Im Gegensatz dazu sind die Strukturen der Leber nach der zweiten Lebensdekade keinen größeren Veränderungen mehr unterworfen, sodass bei Erwachsenen das exakte Lebensalter für die histologische Beurteilung meist eine weniger wichtige Rolle spielt.

Somit ergibt sich aus der Mannigfaltigkeit der möglichen Diagnosen (von denen manche sehr selten sind) im Kontext mit der entwicklungsgeschichtlich bedingten Variabilität der histologischen Norm eine komplexe Situation, der durch enge Zusammenarbeit zwischen Klinikern und Pathologen und durch ein spezielles Armamentarium von histopathologischen, immunhistochemischen und elektronenmikroskopischen Untersuchungen Rechnung getragen werden muss.

Da ein Leberbiopsat eine sehr begrenzte Geweberesource darstellt, sollte ein mehrmaliges Anschneiden des Paraffinblocks wegen des Materialverlusts möglichst vermieden werden, um nach der ersten Beurteilung weitere, für spezifische Fragestellungen erforderliche Untersuchungen zu gewährleisten. Das Ziel unseres Beitrags ist es daher, die wichtigsten, für die effiziente morphologische Beurteilung im ersten Anlauf erforderlichen histochemischen und immunhistochemischen Färbungen und den Einsatz der Elektronenmikroskopie in Bezug zu häufigeren klinischen Fragestellungen bei diffusen Lebererkrankungen zusammenzufassen. Wir sind der Meinung, dass das im Folgenden skizzierte Vorgehen von der klinischen Einschätzung der Diagnose unabhängig  und der Effizienz der morphologischen Differenzialdiagnose sowie dem Aufbau einer histopathologischen Expertise dienlich ist.

Verarbeitung des Biopsiematerials

Es wird die Gewinnung von zumindest zwei Leberbiopsaten empfohlen. Eine der Proben sollte in gepuffertem 4 %igem Formaldehyd und die zweite Probe, nach 3 h in dem hausüblichen Elektronenmikroskopiefixans, in Cacodylatpuffer gelagert und zur Untersuchung an das pathologische Institut gesandt werden. Cacodylatpuffer stoppt den Fixierungsvorgang. So behält das Gewebe genügend Elastizität, um für den Ultradünnschnitt geeignet zu sein. Das formalinfixierte Präparat wird zur Gänze in Paraffin eingebettet. Biopsieschwämmchen sollten nicht verwendet werden, da sie eine mechanische Alteration des Lebergewebes hervorrufen.

Folgende histochemische Färbungen werden zur optimalen Unterstützung der wichtigsten orientierenden differenzialdiagnostischen Überlegungen (Tab. 1) empfohlen: Hämatoxylin & Eosin (H&E), Chromotrop-Anilinblau (CAB), evtl. auch eine andere Bindegewebefärbung, Berliner Blau (BBL), Perjodsäure-Schiff-Reaktion („periodic acid-Schiff reaction“, PAS), Diastase-PAS (D-PAS), Retikulin (Gömöri), Rhodanin und Viktoria-Blau. Zusätzlich sollten zwei Schnitte mit Antikörpern gegen Keratin 7 (K7) und Macrosialin (CD68) immunhistochemisch bearbeitet werden. Weitere 5 Schnitte bleiben ungefärbt und dienen als Reserve.

Tab. 1 Histo- und immunhistochemische Untersuchungen bei der Differenzialdiagnose diffuser Lebererkrankungen
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Aus der Mitte des Pufferbiopsats werden 2 etwa 1 mm große Stücke in Osmiumtetroxyd nachfixiert sowie in Harz eingebettet. Vor der elektronenmikroskopischen Untersuchung werden Semidünnschnitte azangefärbt und lichtmikroskopisch durchgesehen. Repräsentatives Material wird bei Bedarf elektronenmikroskopisch untersucht. Das restliche Material, sofern für die elektronenmikroskopische Analyse nicht weiter erforderlich, wird in Paraffin eingebettet und für die Lichtmikroskopie aufgearbeitet.

Klinische Angaben sind für differenzialdiagnostische Überlegungen wesentlich und sollten neben der Anamnese und radiologischen Befunden auch biochemische Angaben, zumindest: Gesamtbilirubin, konjugiertes Bilirubin, Aspartat-Aminotransferase (AST), Alanin-Aminotransferase (ALT), Gamma-Glutamyltransferase (GGT), Albumin und Gesamtglobulin, und eine klare klinische Fragestellung enthalten.

Elektronenmikroskopische Untersuchung

Obwohl klinisch-biochemische und/oder genetische Tests häufig eine Diagnose ermöglichen, gehört die Abklärung einer Cholestase bei Neugeborenen oder einer Hepatosplenomegalie bei etwas älteren Kindern zu den häufigsten Fragestellungen einer histopathologischen Untersuchung einer diffusen Lebererkrankung. In diesen Fällen dient die Histologie zur Bestätigung oder Exklusion der klinischen Diagnose bei nicht eindeutigen klinischen Befunden. So sollte v. a. bei Verdacht auf Speicherkrankheiten, Mitochondriopathien und Formen intrahepatischer Cholestase immer Material für elektronenmikroskopische Untersuchungen bereitgestellt und archiviert werden. Aus archiviertem Material können auch nachträglich Diagnosen, z. B. nach Neubeschreibungen krankheitsverursachender genetischer Alterationen, gestellt werden [1]. Des Weiteren ergeben sich manchmal in der lichtmikroskopischen Untersuchung unvorhergesehene Befunde, die mittels Elektronenmikroskopie weiter abgeklärt werden müssen.

Morphologische Untersuchungen bei diffusen Lebererkrankungen

Abklärung einer Hepatitis

Obwohl die histologischen Kennzeichen einer Hepatitis mit den Routinefärbungen ausreichend beurteilt werden können, bieten einige weitere histochemische Färbungen nützliche Informationen. So kann das Ausmaß des Parenchymkollaps durch die Retikulinfärbung erfasst oder die Chronizität durch den Nachweis elastischer Fasern in der Viktoria-Blau-Färbung besser evaluiert werden. Die CAB-Färbung kann bei dem Verdacht einer Steatohepatitis den Nachweis von Mallory-Denk-Körpern (MDK) wesentlich erleichtern. MDK sind blau gefärbt, ältere MDK zeigen manchmal eine teilweise rote Färbung im Zentrum der Aggregate. Auch Gallepigment ist in dieser Färbung wegen der Kontrastierung gut zu erkennen.

Abklärung einer Hepatosplenomegalie

Bei der Abklärung von fraglichen Speicherkrankheiten sind der Einsatz und die Ergebnisse der elektronenmikroskopischen Untersuchung und der D‑PAS-Färbung allgemein bekannt. Lichtmikroskopisch leistet die D‑PAS-Färbung bei der Detektion zytoplasmatischer Ablagerungen in Leber- und Kupffer-Zellen und anderen Makrophagen wertvolle Dienste, da diese in der H&E-Histologie häufig schwer erkennbar sind. Beispielsweise sind die globulären zytoplasmatischen Inklusionen bei α1-Antitrypsin(AAT)-Mangel D‑PAS-positiv. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass in den ersten 3 Lebensmonaten physiologische Kupfer- und Eisenablagerungen ebenfalls als D‑PAS-positive granuläre Inklusionen im Zytoplasma auftreten und nicht mit den Ablagerungen von missgefaltetem AAT verwechselt werden sollten.

CD68 ist ein wertvoller immunhistochemischer Marker zur Detektion oder Ausschluss von zytoplasmatischen Ablagerungen in Makrophagen und spielt damit bei der Differenzialdiagnose von reaktiven Veränderungen und Speicherkrankheiten eine wichtige Rolle (Abb. 1a–c).

Abb. 1
figure 1

Kleinkind mit Missbildungen und Entwicklungsverzögerung, Hepatomegalie und hohem GGT-Spiegel: a Ansammlungen von Makrophagen mit vakuolisiertem Zytoplasma im Portalfeld (H&E, Vergr. 1:400). b Die Makrophagen sind D‑PAS-negativ (D-PAS-Färbung, Vergr. 1:400). c Bei der immunhistochemischen Untersuchung mit Antikörpern gegen CD68 ist das Zytoplasma der Makrophagen markiert, die Vakuolen sind hingegen negativ. Somit ergibt sich der Verdacht auf eine Speicherkrankheit (CD68-Immunhistochemie, Vergr. 1:400)

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Abklärung von Veränderungen des Eisen- oder Kupferhaushaltes

Primäre Erkrankungen des Eisenstoffwechsels führen bei JP nur selten zu einer histochemisch nachweisbaren, ausgeprägteren hepatozellulären Siderose. Die Berliner-Blau-Färbung ist eine sensitive Methode, um Eisenspeicherung in der Leber nachzuweisen.

Die Leber des reifen Neugeborenen ist reich an Eisen und Kupfer aus dem mütterlichen Organismus. Die Hepatozyten aller Läppchenabschnitte können histochemisch darstellbares Eisen enthalten (Abb. 2). In diesem Alter darf also Eisen nicht als Hinweis auf eine hereditäre Eisenspeicherkrankheit gewertet werden.

Abb. 2
figure 2

Termingeborener 4 Wochen alter Säugling mit Gelbsucht und cholangiographisch bestätigter Gallengangsatresie. Eisenablagerungen in periportalen Hepatozyten (Berliner-Blau-Färbung, Vergr. 1:100)

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Dies trifft auch auf das Syndrom der sog. „neonatalen Hämochromatose“ zu, bei dem wegen einer schweren intrauterinen Leberschädigung Eisen v. a. leberextern abgelagert wird: Für diese Diagnose ist nicht das Lebereisen (das sowieso vorhanden ist), sondern Eisenablagerungen in Myokard, Pankreas usw. maßgeblich. Eisen wird bei regelrechter Entwicklung innerhalb des ersten Lebensjahres im Organismus verteilt. Bei Säuglingen ohne Wachstumsretardation ist eine Eisenspeicherung in der Leber in der Regel nach dem 3. Lebensmonat histochemisch nicht mehr detektierbar.

In den Zellen des retikuloendothelialen Systems (mesenchymale Siderose) ist jedoch nach Bluttransfusionen und/oder hämatologischen Erkrankungen regelmäßig zu sehen. Eisenspeicherung in Makrophagen kann aber auch einen vorangegangenen Leberparenchymschaden mit Zellzerfall anzeigen.

Da die Zellen der duktularen Reaktion möglicherweise im Rahmen einer Metaplasie aus periportalen Hepatozyten entstehen, kann Eisen auch in den Zellen von Neocholangiolen vorhanden sein.

Auch Kupfer und kupferbindendes Protein (Metallothionein) sind in der Leber von reifen Neugeborenen bei Ausschluss einer Cholestase als physiologisch anzusehen und mittels Rhodanin- bzw. Viktoria-Blau-Färbung bis zum Ende des 3. Lebensmonats nachweisbar (Abb. 3).

Abb. 3
figure 3

Termingeborener 4 Wochen alter Säugling: physiologische Speicherung von kupferbindendem Protein in periportalen Hepatozyten (Viktoria-Blau-Färbung, Vergr. 1:400)

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Die Ablagerungen von Kupfer und kupferbindendem Protein sind üblicherweise im Vergleich zu den physiologischen Siderinablagerungen weniger reichlich. Sie sind auf die Leberzellen der periportalen Läppchenabschnitte beschränkt und stellen in diesem Lebensalter keinen Hinweis auf eine Kupferspeicherung im Rahmen eines Morbus (Mb) Wilson dar. Bei älteren Kindern und Verdacht auf Mb Wilson sind die Rhodanin- und Viktoria-Blau-Färbungen aber wichtige Methoden zum Nachweis der vermehrten Speicherung von Kupfer und Metallothionein. Da die Kupferspeicherung in der Leber bei Mb Wilson jedoch sehr fokal ausgeprägt ist, schließt ein negatives Ergebnis dieser Färbungen einen Mb Wilson bekanntlich nicht aus. Kupferspeicherung in periportalen Hepatozyten kommt ähnlich wie bei Mb Wilson auch bei chronischen venösen Abflussstörungen, z. B. beim Budd-Chiari-Syndrom, vor. Auch bei einer Autoimmunhepatitis kann Kupfer- und Methallothioneinspeicherung in periportalen Hepatozyten ein wichtiges Indiz für eine cholangiopathische Komponente und damit ein Overlap-Syndrom sein.

Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Situationen kommt es bei „multidrug resistance protein 3“-defizienzassoziierter Cholangiopathie zu panlobulären hepatozellulären Ablagerungen von Kupfer [2, 3]. Konträr zum Mb Wilson bestehen aber ein stark erhöhter GGT-Spiegel und keine Verfettung von Leberzellen.

Abklärung einer Cholestase

Histologische Untersuchungen bei cholestatischen Erkrankungen erfordern die Evaluierung und Bestimmung der Anzahl der interlobulären Gallengänge. Nützliche Methoden in diesem Zusammenhang sind die D‑PAS-Färbung zur Darstellung der duktalen Basalmembran und immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen CD68 und K7 zur Detektion von Makrophagen in portalen entzündlichen Infiltraten bzw. der Darstellung der interlobulären Gallengänge und der duktularen Reaktion. Bei chronisch-cholestatischen Situationen, die nicht notwendigerweise mit einer Bilirubinerhöhung im Blut assoziiert sein müssen, kommt es auch im Rahmen von metaplastischen Mechanismen zu aberranter Expression von „cholangiozellulärem“ K7 in periportalen Hepatozyten (sog. Leberzellen vom intermediären Typ). In unserer Erfahrung kann Cholestase in der kindlichen Leber auch mit schwacher immunhistochemisch nachweisbarer K7-Expression in zentrilobulären Hepatozyten assoziiert sein.

Anmerkungen zur Interpretation K7-positiver Zellen bei der Abklärung einer Duktopenie

Die Diagnose einer Duktopenie („paucity of interlobular bile ducts“, PIBD) sollte unserer Meinung nach bei Neugeborenen nur sehr vorsichtig und nach immunhistochemischer Untersuchung mit Antikörpern gegen K7 gestellt werden. Die Unreife des Gallengangssystems bei Neugeborenen kann mit einer Hypoplasie der kleinsten Gallengangäste assoziiert sein, besonders wenn intrahepatische, intralobuläre oder hepatozelluläre Cholestase vorhanden ist und dem Wachstum der Gallengänge nötige, in der Galle enthaltene trophische Faktoren deshalb fehlen. Naturgemäß ist dies in subkapsulären Leberabschnitten, wie sie zumeist in dem Biopsat vorliegen, häufiger als in zentralen Leberabschnitten zu sehen. Die subkapsuläre Leber ist ontogenetisch jünger, sozusagen unter cholestatischen Umständen entstanden. Immunhistochemisch ist in diesen Fällen der interlobuläre Gallengang als Anlage in Form von vereinzelten K7-positiven Cholangiozyten im Portalfeld nachweisbar. Bei entsprechender Alimentation und ontogenetischer Entwicklung ist eine Ausreifung zum regelrechten interlobulären Gallengang möglich. Bei „echter“ PIBD wie bei Alagille-Syndrom fehlen interlobuläre Gallengänge jedoch in den meisten Portalfeldern und die K7-Färbung ist negativ. Rarifikation von Gallengängen und Duktopenie können sich auch erst einige Monate nach der Geburt entwickeln, wenn die postnatale Bildung und Reifung der Gallengänge unterbleibt. Zusammenfassend sollte eine Diagnose einer PIBD nur bei älteren Säuglingen oder als erworbene (sekundäre) PIBD im Rahmen einer Abstoßung oder einer Graft-vs.-host-Reaktion nach Leber- bzw. Knochenmarktransplantation unter Berücksichtigung der Ergebnisse der K7-Immunhistochemie gestellt werden.

Anmerkungen zur Abklärung einer Gallengangsatresie

Eine möglichst frühzeitige Diagnose ist für effizientes palliatives Management einer extrahepatischen biliären Atresie (EHBA) wesentlich. Die wichtigste Aufgabe der histopathologischen Untersuchung ist es deshalb zu klären, ob die histologischen Veränderungen mit einer EBHA vereinbar und eine Cholangiographie als diagnostischer Test indiziert ist. Das wichtigste histologische Merkmal in diesem Zusammenhang ist der Nachweis eines Gallethrombus in einem interlobulären Gallengang, der im Gegensatz zu Strukturen der duktularen Reaktion innerhalb des Portalfeldes liegt und allseits von portalem Mesenchym umgeben ist. In dieser Situation sind tiefere Schnittstufen zur Erhöhung der Sensitivität der histologischen Untersuchung und die CAB-Färbung zur Identifizierung der Galle hilfreich. Falls erforderlich kann auch eine Fouchet-Färbung zum Gallenachweis eingesetzt werden.

Da eine Vielzahl von Faktoren eine Cholestase auslösen können, sollte vor der immunhistochemischen Untersuchung der Expression von Proteinen, die an der Produktion von Gallebestandteilen und deren Sekretion beteiligt sind, jedenfalls die Ergebnisse metabolischer Tests abgewartet werden.

Abklärung einer portalen Hypertension

Die Retikulinfaserfärbung kann zusätzlich zu den routinemäßig verwendeten Bindegewebefärbungen wie der CAB-Färbung verwendet werden, um die Beurteilung der Architektur des lobulären Parenchyms zu erleichtern. Bei nicht-zirrhotischer portaler Hypertension (NCPH) können Veränderungen der Architektur (z. B. sinusoidale Ektasie, irreguläre Abstände zwischen Portalfeldern und Zentralvenen, zarte perisinusoidale Fibrose, fokale Verschmälerung und/oder Verbreiterung der Leberzellplatten in der H&E- oder der CAB-Färbung) nur diskret ausgeprägt sein und leicht übersehen werden.

Fazit für die Praxis

  • Die histopathologische Untersuchung von Leberbiopsaten junger Patienten trägt in vielen Fällen wesentlich zur Abklärung der Ursachen von Lebererkrankungen bei.

  • Die Abklärung und der Materialverbrauch können durch ein erweitertes Spektrum an morphologischen Routineuntersuchungen effizient gesteuert werden.

  • Die Gewinnung von elektronenmikroskopiefähigem Material sollte bei möglichst jeder Leberbiopsie junger Patienten angestrebt werden.