Lichtstrahlen, Photonen, Fluoreszenz: Die optische Bildgebung erlebte eine reiche Geschichte. Aus den altbekannten mikroskopischen Verfahren haben sich viele neue Bildgebungsmethoden entwickelt. Ihre Anwendungspotenziale in der Medizin sind groß. Eine Zukunftsvision – oder ein realistisches Szenario?

Die optische Bildgebung war infolge ihrer hohen räumlichen Auflösung, molekularen Spezifität und geringen Invasivität immer schon bei der Aufklärung von biologischen und physiologischen Mechanismen in lebenden Proben von hoher Relevanz. Aus historischer Sicht hat man sich schon sehr früh mit dem Thema „Optik“ befasst. Mit der Herstellung von Linsen haben schon die alten Ägypter und Mesopotamier begonnen. Griechische Philosophen entwickelten weiterreichende Theorien über die Phänomene Licht und das Sehen, und später befassten sich die Römer mit der sog. geometrischen Optik, also mit dem Konzept der Lichtausbreitung in der Strahlenform. Die Brille als erstes optisches Instrument wurde im Jahr 1270 gebaut. Die Weiterentwicklungen der geometrischen Optik führten später zum Bau von Teleskopen. Optische Mikroskope wurden möglicherweise im 17. Jahrhundert in ihrer heutigen zusammengesetzten Form entworfen, wobei die erhaltenen Bilder noch sehr verschwommen waren. Die Zusammenarbeit von Ernst Abbe mit Carl Zeiss führte zur Herstellung von apochromatischen Objektiven, die erstmals auf soliden optischen Prinzipien und Linsendesign basierten [29].

Die schnelle Entwicklung neuer fluoreszierender Markierungen hat die Ausbreitung der Fluoreszenzmikroskopie in der Forschung beschleunigt. Fortschritte in der digitalen Bildgebung und Analyse ermöglichen die Durchführung von quantitativen Messungen. Bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts hat man optische Methoden zur verbesserten Erkennung von Hirntumoren bei Patienten eingesetzt [30], während es in den letzten Jahren zur Aufstellung von anspruchsvollen meso- und makroskopischen optischer Bildgebungssysteme kam [32]. Der Erfolg der fluoreszenzoptischen In-vivo-Bildgebungsmethodik ist zu einem großen Teil ihrer Benutzerfreundlichkeit und ihrer hohen Empfindlichkeit zuzuschreiben. Zudem ist sie mit geringen Kosten verbunden und kommt ohne die Verwendung von radioaktiven Tracern aus. Im vorliegenden Übersichtsartikel sollen die wichtigsten optischen In-vivo-Verfahren in der präklinischen Forschung und Klinik vorgestellt und deren Entwicklungsstand aufgezeigt werden.

Optische Kontrastmittel

Der gemeinsame Nenner aller Kontrastmittel in der biomedizinischen optischen Bildgebung ist ihre Fluoreszenzfähigkeit. Ihr Einsatz an lebenden Organismen stammt aus den Erfahrungen der Immunfluoreszenz-Markierungstechniken, die seit dem ersten Bericht von 1941 entwickelt wurden [35]. Typische Vertreter von Fluoreszenzfarbstoffen im diagnostischen Fenster sind Cyanine und ihre Derivate. Seit einigen Jahren kamen fluoreszierende Nanopartikel auf, welche als Quantumdots (QDs) bezeichnet werden und aus Schwermetallen (Cadmium und Selenit) bestehen. Ideale Fluoreszenzfarbstoffe sollen 1) eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, 2) eine ausreichende biologische und Photostabilität und 3) eine angemessene Löslichkeit in wässrigen Umgebungen aufweisen [27]. Die meisten von ihnen besitzen eine geringe Toxizität [4, 36]. Mit dem Ziel, gute Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse zu erreichen, sollten optische Biokonjugate eine hohe Zielaffinität, eine gute Zugänglichkeit zum Zielmolekül und eine schnelle Clearance besitzen. Eine gute Zusammenfassung zu diesem Thema wurde von te Velde et al. publiziert [40].

Die wesentlichen Merkmale der In-vivo-Fluoreszenz-Bildgebung

Eine große Herausforderung aller optischen In-vivo-Bildgebungssysteme ist die Tatsache, dass Photonen in unterschiedlicher Weise mit dem Gewebe interagieren. Die meisten Photonen werden nämlich beim Durchgang durch ein Medium gestreut. Die Intensität von einfach gestreuten Wellen nimmt mit der Tiefe exponentiell ab, was die Eindringtiefe des Lichtes im Gewebe limitiert und infolgedessen eine große Herausforderung bei allen medizinischen optischen Bildgebungsverfahren darstellt. Nur verhältnismäßig wenige Photonen wandern geradlinig durch ein Medium (ballisitisches Verhalten). Nur leicht gestreute Photonen (quasi-ballistisch) zeigen dennoch eine gewisse Kohärenz ([31]; Abb. 1).

Abb. 1
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Das Wanderungsverhalten von Photonen im Gewebe

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Die Aussagekraft der optischen Bildgebung hängt sehr stark von der Beschaffenheit des Gewebes ab. Im Gewebe sind Wasser, Oxyhämoglobin, Desoxyhämoglobin und Lipide die Hauptabsorber von Photonen (sichtbares Lichtspektrum), und intrinsische Fluorophore (NADPH, Kollagen, Elastin und Flavin usw.) können selbst fluoreszieren [13, 23]. Diese Probleme kann man durch die Verwendung von Licht im nahen Infrarotbereich (NIR) minimieren. Photonen der Wellenlängen zwischen 650 und 900 nm wandern effizienter durch das Gewebe als Photonen im sichtbaren Lichtspektrum [16]. Bei weiter zunehmenden Wellenlängen nimmt bekanntermaßen die Fähigkeit der Gewebe ab, Licht zu absorbieren und zu streuen [34]. Im Gegensatz dazu führt das im Gewebe enthaltene Wasser zu einer deutlichen Absorption von Lichtwellenlänge über 900 nm und dadurch zu einer deutlich verringerten Lichttransmission. Unter bestimmten Gesichtspunkten können längere Wellenlängen (1000–1700 nm) auch vorteilhaft für eine In-vivo-Bildgebung sein ([9]; Abb. 2).

Abb. 2
figure 2

Gewebeeindringverhalten von Licht unterschiedlicher Wellenlängen und Beispiele für verschiedene Fluorophore. NIR naher Infrarotbereich, SWNT single-walled carbon nanotubes (deutsch: einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen), RENPs rare-earth doped nanoparticles (deutsch: mit seltenen Erden gedopte Nanopartikel), CFP Blaugrün (cyan) fluoreszierendes Protein, GFP Grün fluoreszierendes Protein, YFP gelb (yellow) fluoreszierendes Protein, RFP rot fluoreszierendes Protein. (Mod. nach [19], mit freundlicher Genehmigung)

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Fluoreszenz-Reflexionsbildgebung

Das Fluoreszenz-Reflexionsbildgebungssystem ist das meist verwendete optische Verfahren in der präklinischen Forschung zur Abbildung von ganzen lebenden Labortieren. Vereinfacht ausgedrückt, handelt es sich dabei um ein zweidimensionales fotografisches Verfahren. Die besagte Technik dient hauptsächlich zum Nachweis oberflächennaher Strukturen (z. B. Tumor-Xenotransplantate) in Labortieren, da die Eindringtiefe von Licht im NIR auf eine Entfernung von 3 bis 7 mm von der Gewebeoberfläche begrenzt ist. Wegen auftretender Photonenabsorptionen und -streuungen kann die Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen beeinträchtigt werden [5]. Daher führt man häufig semiquantitative Analysen der Fluoreszenzintensitäten durch. Die räumliche Auflösung dieser Bildgebungstechnik beträgt ca. 2–3 mm bei einer lokalen Kontrastmittelkonzentrationsempfindlichkeit im nm- bis µm-Bereich. In den meisten Fällen handelt es sich um Anwendungen in der präklinischen Forschung (Mäuse), vereinzelt auch um die intraoperative Visualisierung von Tumoren ([25]; Abb. 3). Die klinische Zukunft dieser Methode liegt vor allem in der intraoperativen Bildgebung zur Abgrenzung von zu entfernenden Gewebearealen.

Abb. 3
figure 3

Target-affine Immunoliposome zur intraoperativen Detektion von Metastasen und Lymphknoten in Mausmodellen. a Fluoreszenzbilder, b Lichtbilder. Bildreihen 1–5: Bild 1 zeigt den Situs der Maus, Bilder 2 bis 5 verschiedene Ausschnitte davon. li liver (Leber), st stomach (Magen), sp spleen (Milz), pa pancreas (Pankreas), ki kidney (Niere), co colon (Kolon). Pfeile: rosa Metastasen im Pankreas, gelb geschwollene krebsartige Lymphknoten, grün Gallenbase. Rote Kästchen: verwendete Ausschnitte für weitere Lichtbildvergrößerungen in der unteren Lichtbildreihe in b (Aus [39], mit freundlicher Genehmigung)

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Fluoreszenzvermittelte Tomographie

Bei der fluoreszenzvermittelten Tomographie (FMT) wird die Fluoreszenz im Körper (Labortiere) aus mehreren Projektionen aufgenommen (über CCD-Kameras). Zur genauen Lokalisation des fluoreszierenden Moleküls dienen theoretische Modelle zur Photonenausbreitung in diffusen Medien und deren Verhalten an Gewebegrenzbereichen (z. B. [10]). Im Allgemeinen liegt die Empfindlichkeit der FMT im nm-Bereich mit einer Nachweisgrenze für Fluorochrome von 1 Pikomol [33]. Die Auflösung beträgt mindestens 500 µm; ungeachtet einiger Verbesserungen bleibt die Photonenstreuung dennoch eine Herausforderung. Um die Ortung der fluoroptischen Signale anatomisch festzulegen und zu verbessern, zieht man Kombinationen der molekularen Fluoreszenztomographie (FMT) mit Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) in Betracht [45]. Die FMT wurde vorzugsweise in der Forschung zur Visualisierung von atherosklerotischen Läsionen und Tumoren eingesetzt (z. B. [1]). In tomographischen Ansätzen am Patienten fokussiert man sich auch andere optische Parameter (z. B. Absorption), wie die Entwicklungen zur sog. diffusen optischen Tomographie zur Darstellung von Tumoren in der Brust zeigen [2].

Multispektrale In-vivo-Bildgebung

Die multispektrale Bildgebung setzt auf die Unterscheidung von Fluoreszenzspektren, indem man mehrere Bilder auf der Grundlage unterschiedlicher Spektraleigenschaften der eingesetzten Fluorophore anfertigt (Abb. 4). Das multispektrale Imaging wurde vornehmlich in der präklinischen Forschung eingesetzt [6, 14, 22]. Es besteht ein hohes Potenzial für eine Übertragung in die klinische Situation, insbesondere im Zusammenhang mit der Erhöhung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses während der intraoperativen Fluoreszenzbildgebung. Eine gute Übersicht zu dieser Methode haben u. a. Lee et al. zusammengestellt [24].

Abb. 4
figure 4

Prinzip der multispektralen Bildgebung in der präklinischen Forschung

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Optoakustische Bildgebung

Wenn ein bestimmter Fluorophor Licht absorbiert, wird ein Teil der absorbierten Energie auch in Wärme umgewandelt, was eine thermoelastische Ausdehnung und folglich die Emission von akustischen Wellen verursacht [7]. Mit der optoakustischen Bildgebung werden derartige optoakustische Impulse registriert und ausgewertet. Somit basiert diese Methode nicht direkt auf die Ermittlung von Fluoreszenzemissionen. Sie wird vor allem verwendet, um die räumliche Lokalisation der extrinsischen (z. B. ICG) oder intrinsischen Gewebechromophoren Oxyhämoglobin und Desoxyhämoglobin zu bestimmen [26]. Ihre Empfindlichkeit liegt im nm- bis µm-Bereich, die räumliche Auflösung bei etwa 20 nm, wobei Letztere durch die Dämpfung akustischer Frequenzen im Gewebe begrenzt ist [32]. In letzter Zeit ist diese Technologie soweit ausgereift, dass auch eine hochleistungsfähige biomedizinische Bildgebung beim Menschen außerhalb spezieller Laborumgebungen machbar ist [17].

Biolumineszenz-Bildgebung

Die Biolumineszenz-Bildgebung nutzt die natürliche sichtbare Lichtemission, die in einigen Pflanzen und Tieren vorkommt, und basiert auf der Bildung von Photonen durch einen chemischen Umwandlungsprozess. Es wird sehr häufig das Enzym Luziferase eingesetzt, welches durch gentechnische Manipulationen in die Zielzellen eingebracht wird (i. d. R. Mäuse; Abb. 5). Nach Injektion von D‑Luziferin kommt es in den Luziferase-tragenden Zellen zur Freisetzung von Photonen. Aufgrund der Notwendigkeit genetischer Manipulationen ist es eine Methode der präklinischen Forschung (z. B. [28]; weitere Informationen geben Übersichtsartikel in [37]).

Abb. 5
figure 5

Prinzip der Biolumineszenz-Bildgebung zur nichtinvasiven Darstellung von grundlegenden biologischen Prozessen in der präklinischen Forschung. (Mod. nach [43], mit freundlicher Genehmigung)

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Optische Kohärenztomographie

Die optische Kohärenztomographie (OCT) ist eine körperregionale klinische Bildgebungsmethode. Um beugungsbegrenzte Bilder zu erzeugen, nutzt man die Detektion von ballistischen Photonen, wobei eine sehr gute räumliche Auflösung in der Größenordnung von bis zu 1 bis 10 µm erreichen kann. Häufig werden auch quasi-ballistische Photonen in die Messungen einbezogen, um das Signal-Rausch-Verhältnis weiter zu optimieren. Da die Menge der ballistischen Photonen mit zunehmender Entfernung von der Gewebeoberfläche abnimmt, werden ausgeklügelte Bildverarbeitungstechniken zur Erfassung vielseitiger Merkmale von ballistischen Photonen einbezogen. Die OCT wird hauptsächlich in der Augenheilkunde zur Darstellung von Blutgefäßen bis auf die Kapillarebene im Rahmen der Detektion von Erkrankungen der Netzhaut [12] verwendet. Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Tumorfrüherkennung in der Dermatologie [42].

Optische Spektroskopie

Die optische bildgebende Spektroskopie wird in der klinischen Praxis gerne eingesetzt, um die Anzahl unnötiger Biopsien in Organen mit guter Lichtzugänglichkeit zu verringern (z. B. dem Darm). Da Zelldefekte in frühen Erkrankungsphasen nicht mit herkömmlicher Weißlichtendoskopie erkannt werden, setzt man zunehmend auf den zusätzlichen Einsatz der Fluoreszenzspektroskopie [41], deren Bildgebungsqualität stark von der Qualität der Faseroptik abhängt. Ein typisches Anwendungsgebiete ist die Frühdetektion von Krebs [38] in der klinischen Situation. (Für weitere Informationen sei auf Übersichtsartikel z. B. in [19] verwiesen).

Raman-Spektroskopie

Die Raman-Spektroskopie erfasst inelastische Photonenstreuungen an Molekülen oder Festkörpern (Raman-Streuung [8]) und kann somit Details zur chemischen Zusammensetzung und zu den molekularen Strukturen in Zellen und Geweben liefern. Es sind keine Molekülmarkierungen und keine Probenpräparationen erforderlich, gleichzeitig ist die räumliche Auflösung hoch [21]. Die größte Herausforderung ist jedoch das schwache Raman-Signal [11]. Die Methode befindet sich im Entwicklungsstadium. Ein typisches Beispiel ist die Untersuchung von Magengewebe zur Krebsdetektion [18]. Voraussichtlich können auch Kontrastmittel in Form von nanoskaligen Metall- oder Kolloidoberflächen die Signalgebung in der Raman-Spektroskopie verstärken [44]. Klinisches Potenzial hat die Raman-Spektroskopie zum Nachweis von Krebs und Krebsvorstufen im Darm (Endoskopie) und der intraoperativen Bildgebung (z. B. Tumorresektion). In diesem Zusammenhang wurden schon mehrere Erprobungsstudien im klinischen Umfeld durchgeführt ([3]; Abb. 6).

Abb. 6
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Beispielhaftes Gerätesystem zur Raman-Spektroskopie im Rahmen von klinischen Erprobungsstudien. Spektroskopisches Datenerfassungs- und Visualisierungssystem mit robotisierter Navigation (Solais, Synaptive, Toronto, Kanada). (Mod. nach [15], mit freundlicher Genehmigung)

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Die Fluoreszenzspektroskopie liefert Informationen über den Zellstoffwechsel, wobei die Fluoreszenz von definierten gewebeintrinsischen Fluorophoren (NADH-, NADPH- und FAD) erfasst und verarbeitet wird. In erkrankten Zellen sind bekanntlich verschiedene Stoffwechselwege gestört, wodurch sich das Redox-Gleichgewicht und die Konzentration der Metaboliten mit fortschreitendem Erkrankungsverlauf verändert. Diese Methode befindet sich noch im Forschungs- und Entwicklungsstadium [20]. Strenggenommen handelt es sich hierbei nicht um ein bildgebendes Verfahren.

Lokale multimodale Spektroskopie

Da alle spektroskopischen Techniken inhärente Vor- und Nachteile besitzen, unternimmt man Versuche mit dem Ziel, mehrere spektroskopische Techniken in einem Gerät zu kombinieren. Für nähere Informationen sei auf weitere Literaturstellen verwiesen (z. B. [19]).

Fazit für die Praxis

  • Optische Bildgebungstechniken sind sehr vielfältig und nutzen im Wesentlichen die Absorptions- bzw. Fluoreszenzeigenschaften von Fluorophoren.

  • Die ganzkörperoptische Bildgebung ist auf Labortiere beschränkt (z. B. Fluoreszenzbildgebung, Optoakustik etc.)

  • Die regionale optische Bildgebung hat ihren Einzug in die klinische Praxis schon vollzogen (z. B. Fluoreszenz-Spektroskopie, Optoakustik, optische Kohärenztomographie etc.)

  • Beachtenswert sind die günstigen physikalischen und biologischen Bedingungen bei der Verwendung von Licht im nahen Infrarotbereich.

  • Aufgrund ihrer hohen Benutzerfreundlichkeit lassen sich optische Bildgebungsmethoden auch außerhalb der Radiologie einsetzen.