Combination of EGFR/HER2 Tyrosine Kinase Inhibition by BIBW 2992 and BIBW 2669 with Irradiation in FaDu Human Squamous Cell Carcinoma

Purpose:

To investigate the effect of the dual EGFR/HER2 (ErbB2) tyrosine kinase inhibitors BIBW 2992 and BIBW 2669 on proliferation and clonogenic cell survival of FaDu human squamous cell carcinoma in vitro, and on tumor growth after single-dose irradiation in nude mice.

Material and Methods:

Cell proliferation, cell-cycle distribution and clonogenic cell survival after irradiation were assayed with and without BIBW 2992 or BIBW 2669 (3, 30, and 300 nM) in vitro. Tumor volume and tumor growth delay (GD_V2) were determined in tumors growing in NMRI (nu/nu) nude mice, treated with (a) BIBW 2992 (20 mg kg^–1 body weight orally), BIBW 2669 (3–4 mg kg^–1 body weight orally) or carrier until a final tumor diameter of 15 mm, or, (b) 3 days before a 20-Gy single-dose irradiation or, (c) after a 20-Gy single-dose irradiation until reaching the final tumor diameter.

Results:

BIBW 2992 and BIBW 2669 significantly increased the doubling time of FaDu cells in vitro. A marked dose-dependent antiproliferative effect with blockade of the cells in G0/G1-phase of the cell cycle was found. Incubation with BIBW 2669 or BIBW 2992 for 3 days marginally increased radiosensitivity of FaDu cells in vitro. For BIBW 2992, this effect was statistically significant (p = 0.006). Daily oral application of BIBW 2669 or BIBW 2992 in mice bearing unirradiated FaDu tumors showed a marked antiproliferative effect with a significant prolongation of tumor growth delay (p < 0.0001). After drug application for 3 days, followed by 20-Gy single-dose irradiation, a slight effect of both drugs on tumor growth delay was seen. For BIBW 2669, this effect was statistically significant (p = 0.007). However, this effect disappeared when tumor volumes were normalized to the time point of irradiation suggesting that both drugs showed no or only a slight radiosensitizing effect in vivo. Daily application of BIBW 2669 or BIBW 2992 after a single-dose irradiation showed a clear inhibition of tumor growth with a significantly longer tumor growth delay after drug treatment compared to control tumors (p < 0.002). Enhancement ratios were smaller for irradiated than for unirradiated tumors, suggesting an additive effect for combinations with radiotherapy. In all treatment arms, the effects of BIBW 2669 were not significantly different from BIBW 2992.

Conclusion:

BIBW 2669 and BIBW 2992 showed a clear antiproliferative effect in vitro, whereas radiosensitization was only marginal. The present data are the first to show an effect of combined irradiation and dual EGFR/ErbB2 inhibition on tumor growth delay in vivo. Further preclinical investigations using fractionated irradiation schedules and local tumor control as experimental endpoint are needed to evaluate a possible curative potential for the combination treatment.

Ziel:

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der neuen dualen EGFR/HER2-Tyrosinkinaseinhibitoren BIBW 2992 und BIBW 2669 auf die Zellproliferation und das klonogene Zellüberleben in der humanen Plattenepithelkarzinomlinie FaDu in vitro sowie auf das Tumorwachstum und die Tumorwachstumsverzögerung nach Einzeldosisbestrahlung in vivo untersucht.

Material und Methodik:

Zellproliferation, Zellzyklusverteilung und klonogenes Zellüberleben nach Bestrahlung wurden mit und ohne BIBW 2992 oder BIBW 2669 (3, 30 und 300 nM) in vitro untersucht. In NMRI-(nu/nu-)Nacktmäusen wurden Tumorvolumen und Tumorwachstumsverzögerung (GD_V2) nach a) alleiniger Applikation von BIBW 2992 (20 mg kg^–1 KG oral), BIBW 2669 (3–4 mg kg^–1 KG oral) oder Kontrollsubstanz bis zur Tumorendgröße von 15 mm, b) 3-tägiger Substanzapplikation und folgender 20-Gy-Einzeldosisbestrahlung und c) 20-Gy-Einzeldosisbestrahlung bis zur Tumorendgröße bestimmt.

Ergebnisse:

BIBW 2992 und BIBW 2669 führten zu einer signifikanten Verlängerung der Verdopplungszeit von FaDu-Zellen in vitro (Abbildung 1, Tabelle 1). Der ausgeprägte dosisabhängige antiproliferative Effekt ging mit einem G0/G1-Block einher (Abbildungen 1 und 2). Die Inkubation mit BIBW 2669 und BIBW 2992 führte zu einer geringen Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit von FaDu-Zellen in vitro (Abbildung 3). Dieser Effekt war für BIBW 2992 statistisch signifikant (p = 0,006). Die tägliche orale Applikation von BIBW 2669 oder BIBW 2992 führte bei unbestrahlten Tumoren in vivo zu einem deutlichen proliferationshemmenden Effekt (Abbildung 4) mit signifikanter Verlängerung der Tumorwachstumsverzögerung (p < 0,0001; Abbildung 6, Tabelle 2). Eine 3-tägige Substanzapplikation und anschließende 20-Gy-Einzeldosisbestrahlung zeigten einen geringen Effekt auf die Tumorwachstumsverzögerung. Für BIBW 2669 war dieser Effekt signifikant (p = 0,007). Der Effekt verschwand, wenn die Tumorvolumina zum Zeitpunkt der Bestrahlung normiert wurden (Abbildung 5). Für beide Substanzen konnte somit kein oder nur ein geringer strahlensensitivierender Effekt in vivo nachgewiesen werden. Eine Einzeldosisbestrahlung mit 20 Gy und anschließender Substanzapplikation bis zur Tumorendgröße führte zusätzlich zum Effekt der Bestrahlung zu einem deutlichen proliferationshemmenden Effekt mit signifikanter Verlängerung der Tumorwachstumsverzögerung im Vergleich zu Kontrolltumoren (p < 0,002). Die Verstärkungsratios waren bei bestrahlten Tumoren geringer als bei unbestrahlten Tumoren, was auf einen additiven Effekt der Substanzen schließen lässt. In allen Behandlungsarmen konnte zwischen BIBW 2669 und BIBW 2992 kein signifikanter Unterschied gefunden werden.

Schlussfolgerung:

BIBW 2669 und BIBW 2992 zeigten einen deutlichen antiproliferativen Effekt in vitro bei nur geringer Strahlensensitivierung. Die vorliegenden Daten haben erstmals die Wirkung einer kombinierten Bestrahlung und dualen EGFR/ ErbB2-Inhibition auf die Verzögerung des Tumorwachstums in vivo gezeigt. Weitere präklinische Untersuchungen mit einem fraktionierten Bestrahlungsschema und lokaler Tumorkontrolle als Endpunkt sind nötig, um ein mögliches kuratives Potential von BIBW 2669 oder BIBW 2992 in Kombination mit Strahlentherapie zu untersuchen.