The Induction of TGF-β₁ and NF-κB Parallels a Biphasic Time Course of Leukocyte/Endothelial Cell Adhesion Following Low-Dose X-Irradiation

Background and Purpose:

Low-dose radiotherapy (LD-RT) is known to exert an anti-inflammatory effect, but the knowledge of the underlying molecular mechanisms is still scarce. The authors have recently reported that transforming growth factor beta 1 (TGF-β₁) essentially contributes to a reduced endothelial adhesion of mononuclear cells (PBMC) following LD-RT. Furthermore, TGF-β₁ secretion was associated with the induction of the transcription factor nuclear factor kappa B (NF-κB). However, the time course of adhesion, TGF-β₁ expression, and NF-κB activity following LD-RT has not been thoroughly investigated yet.

Material and Methods:

The human EA.hy.926 endothelial cell line (EA.hy.926 EC) was grown to 95% confluence. Immediately after stimulation with the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNF-α), EA.hy.926 EC were irradiated with single doses ranging from 0.3 up to 3 Gy. Adhesion assays were performed 4, 12, and 24 h after irradiation. Nuclear extracts and culture supernatants were harvested after 4, 8, 12, 20, 24, 30, and 40 h. NF-κB DNA-binding activity was analyzed by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and TGF-β₁ secretion by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The functional impact of TGF-β₁ on the course of leukocyte/EC adhesion was analyzed by neutralizing TGF-β₁ in parallel with stimulation/irradiation of the EA.hy.926 EC.

Results:

4 and 24 h after irradiation of EA.hy.926 EC in the dose range between 0.3 and 0.7 Gy, a reduced adhesion of PBMC compared to nontreated controls could be observed. However, 12 h after irradiation a relative maximum of adhesion (up to 30% increase) was seen at a dose of 0.3 Gy. TGF-β₁ secretion and NF-κB DNA-binding activity displayed a similar biphasic kinetics of induction with a relative minimum 12 h after irradiation. Neutralization of TGF-β₁ activity restored adhesion at 4 and 24 h after LD-RT of EA.hy.926 EC, but it did not influence leukocyte adhesion 12 h after irradiation.

Conclusion:

LD-RT of stimulated human EA.hy.926 EC is followed by a biphasic time course of NF-κB activity and an increased secretion of TGF-β₁. The kinetics shows peak levels at 4–8 h and 24–30 h after LD-RT and results in a biphasic leukocyte/EC adhesion profile.

Hintergrund und Fragestellung:

Eine niedrig dosierte Strahlentherapie (LD-RT) zeigt klinisch einen antiinflammatorischen Effekt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch noch wenig untersucht. Die Autoren konnten kürzlich zeigen, dass “Transforming Growth Factor beta 1” (TGF-β₁) zu einer verminderten Adhäsion von mononukleären Zellen (PBMC) an Endothelzellen nach LD-RT beiträgt. Dabei war die TGF-β₁-Sekretion mit der Induktion des Transkriptionsfaktors “Nuclear Factor kappa B” (NF-κB) assoziiert. Die zeitliche Abhängigkeit der Adhäsion, der TGF-β₁-Sekretion und der NF-κB-DNA-Bindungsaktivität nach LD-RT ist bisher allerdings kaum untersucht.

Material und Methodik:

Die humane Endothelzelllinie EA.hy.926 wurde bis zu 95% Konfluenz kultiviert. Sofort nach Stimulierung mit dem proinflammatorischen Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α) wurden die Zellen mit Einzeldosen zwischen 0,3 und 3 Gy bestrahlt. Nach 4, 12 und 24 h wurden dann Adhäsionsassays durchgeführt. Nukleäre Extrakte und Kulturüberstände wurden nach 4, 8, 12, 20, 24, 30 und 40 h gewonnen. Die Messung der NF-κB-DNA-Bindungsaktivität erfolgte mittels EMSA („Electrophoretic Mobility Shift Assay“), die TGF-β₁-Sekretion wurde in einem ELISA („Enzyme-Linked Immunosorbent Assay“) bestimmt. Eine funktionelle Relevanz von TGF-β₁ für den Verlauf der Leukozytenadhäsion wurde durch Behandlung mit neutralisierenden Antikörpern parallel zur Stimulation/Bestrahlung von EA.hy.926-Endothelzellen untersucht.

Ergebnisse:

4 und 24 h nach Bestrahlung aktivierter EA.hy.926-Endothelzellen war im Dosisbereich von 0,3 bis 0,7 Gy eine verminderte Leukozytenadhäsion im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle zu beobachten. Überraschenderweise zeigte sich 12 h nach Bestrahlung ein relatives Adhäsionsmaximum (Anstieg um bis zu 30%) bei 0,3 Gy. Die TGF-β₁-Sekretion und NF-κB-DNA-Bindungsaktivität wiesen eine vergleichbare biphasische Kinetik mit einem relativen Minimum 12 h nach Bestrahlung auf. Eine Neutralisation der TGF-β₁-Aktivität führte zur Wiederherstellung der Adhäsion an EA.hy.926-Endothelzellen 4 und 24 h nach LD-RT, die gesteigerte Adhäsion 12 h nach Bestrahlung wurde hingegen nicht beeinflusst.

Schlussfolgerung:

Die LD-RT stimulierter humaner EA.hy.926-Endothelzellen führt zu einer biphasischen Zeitabhängigkeit der NF-κB-DNA-Bindungsaktivität und TGF-β₁-Sekretion. Dabei zeigt die Kinetik relative Maxima nach 4–8 h und 24–30 h und resultiert in einem biphasischen Profil der Adhäsion von Leukozyten an die Endothelzellen.