Purified angiotensin converting enzyme from Rana esculenta ovary influences ovarian steroidogenesis in vitro

Abstract

The aim of the present study was to purify and characterize angiotensin-converting enzyme (ACE) present in frog ovary (Rana esculenta). Detergent and trypsin-extracted enzymes were purified using a one-step process, consisting of affinity chromatography on lisinopril coupled to Sepharose 6B. The molecular mass was 150 kDa for both detergent-extracted and trypsin-extracted enzyme. The specific activity of detergent-extracted and trypsin-extracted ACE was 294 U mg⁻¹ and 326 U mg⁻¹ respectively. The optimum pH range was from 7–8.5 at 37°C and the optimum temperature was 50 °C. Optimum chloride concentration was about 200 mM for synthetic substrate FAPGG (N-[3-(2-furyl)acryloyl] L-phenylalanyl glycyl glycine) and angiotensin I, and 10 mM for bradykinin. The K_m and K_cat values for FAPGG were 0.608±0.07 mM and 249 sec⁻¹ respectively and I₅₀ values for captopril and lisinopril, two specific ACE inhibitors, were 68±12.55 nM and 6.763±0.66 nM respectively. Frog ovary tissue from prereproductive period was incubated in vitro in the presence of frog ovary ACE (2.5 mU/ml), captopril (0.1 mM), and lisinopril (0.1 mM). Production of 17β-estradiol, progesterone, and prostaglandins E₂ and F_2α was determined. The data showed a modulation of 17β-estradiol, progesterone and prostaglandin E₂ production by ovary ACE.

Resumen

La finalidad de este estudio es la purificación y caracterización de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) contenida en el ovario de rana (Rana esculenta). La enzima, extraída tanto con detergente como con tripsina, se purificó mediante un proceso único, consistente en una cromatografía de afinidad con lisinopril ligado a Sepharose 6B. El peso molecular de la enzima resultó ser de 150 kDa, tanto por la extracción con detergente como con tripsina. La actividad específica de la ACE extraída con detergente y tripsina fue de 294 U mg⁻¹ y 326 U mg⁻¹, respectivamente. El intervalo de pH óptimo fue de 7–8,5 a 37°C y la temperatura óptima, de 50 °C. La concentración molar óptima de cloruro fue sobre 200 mM para el sustrato sintético FAPGG (N-[3-(2-furyl) acryloyl] L-phenylalanyl glycyl glycine) y angiotensina I, y 10 mM para la bradiquinina. Los valores de K_m y K_cat para FAPGG fueron 0,608±0,07 mM y 249 sec⁻¹, respectivamente, y los valores de I₅₀ para captopril y lisinopril, dos inhibidores específicos de ACE, fueron 68±12,55 nM y 6,763±0,66 nM, respectivamente. Tejido ovárico de rana en períodos prerre-productivos se incubó in vitro en presencia de ACE de ovario de rana (2,5 mU/ml), captopril (0,1 mM), y lisinopril (0,1 mM), determinán-dose la producción de 17β-estradiol, progesterona y de prostaglandinas E₂ y F_2α. Los resultados muestran modulación de la producción de 17β-estradiol, progesterona y prostaglandinas E₂ por ACE ovárica.