A colorimetric method using chlorpromazine-5-oxide for the assay of NAD- and NADP-oxidoreductases

Summary

Chlorpromazine-5-oxide (CPZ · O) in the presence of H₂SO₄ and Cl- forms a free radical with absorption maximum at 535 nm. Molar absorptivity at 535 nm of the free radical was found to be (1.12±0.02) 10⁴. The red CPZ · O free radical in H₂SO₄, when diluted with 45% H₃PO₄, is readily reduced by reducing agents, like Fe²⁺, S₂O₃ ^2-, NADH, NADPH and ascorbic acid, to chlor-promazine. Oneμmole NADH/NADPH reduces 2μmoles of the CPZ·O free radical. Details of assay methods for lactate, hydroxybutyrate and malate dehydrogenases are given. The method can also be used in the measurement of enzymes like phosphohexose isomerase and pyruvate kinase by coupled enzyme methods and for assay of isocitrate, glucose-6-phosphate and 6-phosphogluconate dehydrogenases. Results of comparison studies between the colorimetric method and rate analyser methods with lactate, malate, isocitrate and glucose-6-phosphate dehydrogenases are given. The colonmetric results correlated well with Rate Analyser results.

Zusammenfassung

Chlorpromazin-5-oxid (CPZ. O) bildet in Gegenwart von Schwefelsäure und Chloridionen ein freies Radikal mit einem Absorptionsmaximum bei 535 nm, dessen molare Extinktion bei dieser Wellenlänge (1,12±0,02)·10⁴ beträgt. Das rot gefärbte freie Radikal CPZ.O läßt sich in Schwefelsäure nach Verdünnen mit 45% Phosphorsäure leicht mit Fe(II), S₂O₃ ^2-, NADH, NADPH und Ascorbinsäure zu Chlorpromazin reduzieren. Ein Mikromol NADH/NADPH reduziert 2 Mikromole CPZ.O.

Details über die Bestimmung von Laktat-, Hydroxybutyrat- und Malatdehydrogenasen wurden mitgeteilt. Die Methode kann auch für die Bestimmung von Enzymen wie Phosphohexose-Isomerase und Pyruvatkinase durch gekoppelte Enzymmethoden und für die Bestimmung der Isozitrat-, Glucose-6-phosphat- und 6-Phosphogluconat-Dehydrogenasen verwendet werden. Resultate des Vergleichs zwischen der kolorimetrischen Methode und Schnellmethoden zur Bestimmung von Laktat-, Malat-, Isozitrat- und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase zeigen gute Übereinstimmung.