Verluste radioaktiv markierter Substanzen aus Pisum-Wurzeln nach Verfütterung von D-Glucose-¹⁴C im Verlauf unterschiedlicher Präparationsmethoden für die Elektronenmikroskopie

Summary

The losses of marked metabolites of ¹⁴C-glucose in Pisum roots were determined by means of liquid scintillation counting during different electron microscopic preparation schedules. ¹⁴C-glucose was applied to the roots. Metabolites were identified in thinlayer chromatographs and radioautographs. Fixation with glutaraldehyde (glut.) followed by OsO₄ rendered the radioactivity in the tissue less susceptible to ethanolic extraction than treatment with either glut. or OsO₄. The ethanolic extracts showed 76 per cent of their radioactivity in glucose, the remainder in amino acids and nitrogen-free acids. Continuous dehydration by acetone instead of stepwise dehydration by acetone, ethanol, and propylene oxide further reduces extraction. Even better results are achieved by adding sucrose to the fixation and dehydration media. Finally, after fixation with OsO₄ fumes followed by continuous dehydration, most of the incorporated radioactivity is retained in the tissue. The passage through high acetone and ethanol concentrations as well as through propylene oxide and epon does not cause significant losses. Glut. and acroleine do not differ significantly with respect to the retention of radioactivity. In all preparations the larger part of the retained radioactivity is found in glucose. It is suggested that glucose is predominantly retained because of membrane changes during fixation, whereas the amino acid retention is enhanced by reactions with the fixing agents.

Zusammenfassung

Die Verluste an radioaktiv markierten, aus d-Glucose-¹⁴C in Pisum-Wurzeln entstandenen Substanzen, die im Verlauf unterschiedlicher Präparationsmethoden für die Elektronenmikroskopie auftreten, werden mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Die Identifizierung der Metabolite erfolgt an Hand von Dünnschichtchromatogrammen und Autoradiographien. Nach Flüssigfixierung mit Glutaraldehyd (Glut.) und OsO₄ wird weniger äthanollösliche Radioaktivität, die zu ca. 76% in Glucose, sonst aber in Aminosäuren und N-freien Säuren vorliegt, extrahiert, als nach Einzelfixierung mit einem der genannten Fixierungsmittel.

Durch stufenlose Acetonentwässerung, anstelle von Entwässerung in Aceton-bzw. Äthanol-Stufen und Propylenoxyd, ferner durch Zusetzen von Saccharose zu den Fixierungs- und Entwässerungs-Medien, kann die Extraktion weiter reduziert werden. Nach OsO₄-Räucherung und stufenloser Entwässerung bleibt die größte Menge an Radioaktivität im Gewebe. Der Aufenthalt in den hohen Aceton- und Äthanolstufen bringt hier keine hohen Verluste mit sich, dasselbe gilt für Propylenoxyd und Epon. Glut. und Acrolein unterscheiden sich hinsichtlich der Retention an Radioaktivität nicht wesentlich.

In allen Präparationen besteht der größte Teil der verbleibenden Radioaktivität aus Glucose. Es wird vermutet, daß diese hauptsächlich auf Grund von Membranveränderungen zurückbleibt, die Aminosäuren zusätzlich durch ihre Reaktion mit den Fixantien.