Regulationsdefekte bei trifluorleucinresistenten Mutanten von Hydrogenomonas H 16

Summary

• 1. dl-5′,5′,5′-trifluoroleucine exerts a bacteriostatic action on Hydrogenomonas H 16; growth is completely suppressed by the antimetabolite at concentrations higher than 5x10^-5 M. After treatment by 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine mutants were selected which were resistant to 10^-3M trifluoroleucine. Four different types of mutants were recognized: (i) The mutant r 2 is constitutively derepressed for the formation of the enzyme α-isopropylmalate synthetase; the enzyme activity is increased elevenfold. (ii) In the mutant s 8 the enzyme α-isopropylmalate synthetase is insensitive to endproduct inhibition by l-leucine. (iii) Several mutants are constitutively derepressed for the formation of acetohydroxy acid synthase (3 to 23 fold increase of enzyme activity). (iv) In the mutant s 16 the enzyme acetohydroxy acid synthase is insensitive to endproduct inhibition by l-valine.

• 2. Prototrophic revertants of isoleucine or isoleucine-valine requiring auxotrophic mutants of H 16 which produce acetohydroxyacid synthase constitutively or which produce an enzyme with altered valine sensitivity, proved to be resistant to 10^-3 M trifluoroleucine.

• 3. The isolation of mutants carrying regulatory defects in the regulation of the valine-isoleucine biosynthetic pathway by means of trifluoroleucine is due to an unusual property of the α-isopropylmalate synthetase of Hydrogenomonas H 16. l-valine is not only related to the leucine pathway as a precursor, but acts as a positive effector for the first enzyme of the leucine pathway. In this way the overproduction of valine is followed by an overproduction of leucine which finally conferes resistance to the bacteriostatic effect of trifluoroleucine.

• 4. In Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa l-valine does not act antagonistically to leucine at the enzyme α-isopropylmalate synthetase. In Micrococcus denitrificans l-valine acts as a positive effector as it does in Hydrogenomonas H 16.

Zusammenfassung

• 1. dl-5′,5′,5′-Trifluorleucin wirkt auf Hydrogenomonas H 16 bacteriostatisch: der Antimetabolit hemmt das Wachstum in Konzentrationen von mehr als 5 · 10^-5 M. Nach Behandlung mit 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin wurden Resistenzmutanten isoliert, die 10^-3 M Trifluorleucin tolerieren. Es ließen sich 4 verschiedene Mutantentypen unterscheiden: (i) Die Mutante r 2 bildet das erste Enzym des Leucin-Biosyntheseweges, die α-Isopropylmalat-Synthetase, konstitutiv dereprimiert (11 fach erhöhte Enzymaktivität); (ii) die α-Isopropylmalat-Synthetase der Mutante s 8 ist gegenüber der Endprodukthemmung durch l-Leucin unempfindlich. (iii) Mehrere Mutanten bilden die Acetohydroxysäure-Synthase konstitutiv dereprimiert (3–23 fache Erhöhung der Enzymaktivität); (iv) die Acetohydroxysäure-Synthase der Mutante s 16 ist gegenüber der Endprodukthemmung durch l-Valin unempfindlich.

• 2. Von einer isoleucin- und einer isoleucin- und valinauxotrophen Mutante wurden prototrophe Revertanten isoliert. Die Mutanten bilden die Acetohydroxysäure-Synthase konstitutiv oder besitzen ein verändertes Enzym mit geringerer Empfindlichkeit gegen Valin. Sie scheiden Valin aus und erwiesen sich als resistent gegenüber 10^-3 M Trifluorleucin, obwohl sie ohne Trifluorleucin isoliert worden waren.

• 3. Die Selektion von Mutanten, die bezüglich der Regulation des Valin-Isoleucin-Biosyntheseweges defekt sind, mit Hilfe von Trifluorleucin beruht auf einer ungewöhnlichen Eigenschaft der α-Isopropylmalat-Synthetase von Hydrogenomonas H 16: Für dieses Enzym ist l-Valin nicht nur eine Substratvorstufe, sondern wirkt auch als positiver Effektor antagonistisch gegenüber dem Endprodukt l-Leucin. Auf diese Weise hat eine Überproduktion von Valin eine Überproduktion von Leucin zur Folge und führt so zur Resistenz gegenüber der bacteriostatischen Wirkung von Trifluorleucin.

• 4. Für die α-Isopropylmalat-Synthetase von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa ist Valin kein positiver Effektor. Micrococcus denitrificans ähnelt bezüglich dieser Eigenschaft Hydrogenomonas H 16.