Sequenzierung von Nukleinsäuren

Zusammenfassung

1965 haben Holley et al. die Nukleotidsequenz der Alanin-tRNS aus Escherichia coli bestimmt und 1966 Zachau et al. die Sequenz der Serin-tRNS.Als erstes Versuchsobjekt für die Sequenzierung wurde tRNS gewählt, weil die Moleküle relativ kurz sind und eine definierte Länge haben (je nach Art 70–80 Nukleotide). 1967 sequenzierten Sanger und Mitarbeiter die 5S rRNS aus E. coli (120 Nukleotide). Sanger et al. synthetisierten zu diesem Zweck [³²P]-markierte RNS in vivo und erreichten dadurch eine Empfindlichkeitssteigerung des Analyseverfahrens. Die markierte RNS wurde aus Zellen extrahiert und durch spezifisch spaltende Ribonukleasen (s. Kap. 20) unter standardisierten Bedingungen in kürzere Oligonukleotide zerlegt, welche anschließend fraktioniert und getrennt sequenziert werden konnten. Zur Trennung wurden sie einer zweidimensionalen Elektrophorese unterworfen. Die Positionen der einzelnen Oligo- und Mononukleotide wurde autoradiographisch ermittel.