Das „Abschalten“ von Genen

Zusammenfassung

für die Expression von Fremd-Genen eine Rolle spielen. Zu diesem Zweck transformierten sie Nicotiana tabacum (Tabak) in zwei aufeinander folgenden Schritten. Zunächst wurde mittels der Agrobacterium-Trnsformation ein Genkonstrukt aus dem Gen für die Neomycinphosphotransferase II (Kanamycin-Resistenz) und dem für die Nopalinsynthase in die Tabakpflanzen eingebracht, wobei jedes der beiden Gene unter der Regie des Promotors des Nopalinsynthase-Gens stand. Aus den Blattscheiben wurden transgene Tabakpflanzen regeneriert, die beide Merkmale enthielten (Kan⁺, NOS⁺). Blattscheiben dieser ersten Transformanten wurden erneut mittels der Agrobacterium-Methode mit einem Konstrukt aus dem Gen, dessen Expressionsprodukt Hygromycin-Resistenz verleiht, und dem für die Octopinsynthase, transformiert, wobei in diesem Fall jedes der beiden Gene von dem 35S-Promotor und der Termination-Sequenz des CaMV⁵⁶ flankiert wurde. Interessanterweise war in 15% der Doppeltransformanten die Expression der beiden, bei der 1. Transformation übertragenen Gene (Kan⁺, NOS⁺) unterbunden. Aus diesen Doppeltransformanten konnten Nachkommen hervorgehen, bei denen die übertragenen Gene der 1. Transformation wieder exprimiert wurden, dann aber nicht die der 2. Transformation. Die generationsabhängige Inaktivierung/Aktivierung der Gene der 1. Transformation ließ sich auf die Methylierung/Demethylierung der Promotoren dieser Gene zurückführen. Matzke und Matzke (1990) stellen die Hypothese zur Diskussion, dass die zwei eingebrachten T-DNAs mit homologen Abschnitten um Bindungsstellen an der Kern-DNA konkurrieren. In ähnlicher Weise untersuchte Vaucheret (1993, 1994) die gegenseitige Beeinflussung der Expression zweier eingebrachter Konstrukte [35S-Promotor des CaMV/Ni-tritreduktase-Gen aus Nicotiana tabacum (Tabak) in inverser Orientierung; 35S-Promotor des CaMV/ nptII] in Nicotiana tabacum. Aus diesen und anderen Untersuchungen wurde die Hypothese der „Co-Suppression“ entwickelt; das Phänomen wurde in etlichen transgenen Pflanzen festgestellt, denen zusätzlich zu einem endogenen Gen ein entsprechendes Fremd-Gen inseriert worden war. Bei diesen Transformanten handelte es sich zum Beispiel um Petunia hybrida (Petunie) (Chalconsynthase-Gen; Napoli et al, 1990) (Dihydrofla-vonolreduktase-Gen; van der Krol, 1990) (MADS-Abschnitte, Angenent et al, 1993), Lycopersicon esculentum (Tomate) (Polygalacruronase-Gen; Smith et al, 1990) (Pectinesterase-Gen, Seymour et al, 1993) sowie Nicotiana tabacum (Tabak) (Chitinase-Gen; Hart et al, 1992) (Nitratreduktase-Gen; Dorlhac et al, 1994) (Phytoensynthase-Gen; Frey und Grierson, 1993). Ob tatsächlich Co-Suppression der betroffenen Gene in einer Transformante eintritt, ist indes schwer vorhersagbar. Dorlhac et al (1994) transformierten Tabakpflanzen mit einem Konstrukt aus dem 35S-Promotor des CaMV und dem Gen Nia für die Nitratreduktase. In den individuellen Tabaktransformanten konnten sie entweder eine Überproduktion an mRNA für die Nitratreduktase des eingebrachten Konstrukts oder aber Co-Suppression des eingebrachten und des endogenen Nitratreduktase-Gens feststellen. Entsprechende Ergebnisse erbrachte die Transformation von Tabakpflanzen mit Konstrukten aus dem 35S-Promotor des CaMV, zwei 35S-Enhancer-Sequenzen des CaMV sowie dem Gen für die Nitritreduktase (Vaucheret et al, 1995). In den meisten bislang untersuchten Fällen scheint die Voraussetzung für das Eintreten der Co-Suppression eine hohe Expressionsrate des eingebrachten Fremd-Gens zu sein. Indes können die Auswirkungen vieler anderer Parameter derzeit noch nicht ausgeschlossen werden. In Freilandversuchen mit homozygoten transgenen Tabakpflanzen zeigten zwischen 0% und bis zu 57% der Transformanten Co-up pression in Bezug auf die eingebrachte und die endogene Nitratreduktase (Palaqui und Vaucheret, 1995). Ähnliche Ergebnisse erzielten Brandie et al (1995) mit transgenen Tabakpflanzen in einem Freilandversuch, die mit dem Gen csr1-1 für eine Acetohydroxyacidosynthase aus Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) transformiert worden war, welche Resistenz gegen Sulfonyl-harnstoffherbizide verleiht. Bis zu 59% der homozygoten Transformanten waren aufgrund der Co-Suppression nicht gegen eine derartige Herbizidbehandlung resistent.