Zur Aufbereitung von Amnionmembranen mit dem Waterjet

Zusammenfassung

Hintergrund

Die Ex-vivo-Kultivierung von limbalen Stammzellen auf Amnionmembranen kann beschleunigt werden, wenn die membraneigenen Amnionepithelzellen vorher entfernt wurden. Epithelfreie Amnionmembranen werden u. a. zur In-vitro-Kultivierung von autologen oralen Schleimhautepithelzellen zum Zweck der Transplantation bei bilateralen limbalen Stammzellinsuffizienzen verwendet. Die Entfernung der Amnionepithelzellen kann enzymatisch chemisch, ausschließlich mechanisch oder in der Kombination von chemischen und mechanischen Methoden erfolgen.

Material und Methodik

Mit dem Wasserstrahlskalpell wurde die Effektivität der ausschließlich mechanischen Amnionepithelzellentfernung von der Amnionmembran untersucht. Plazenten gesunder Mütter wurden nach Gefrierkonservierung aufgetaut. Eine definierte Amnionmembranoberfläche (d = 15 mm) wurde einer standardisierten Behandlung mit dem Waterjet unterzogen. Am Waterjet wurden 2 verschiedene Düsentypen (Punkt- und Flachstrahldüse) eingesetzt. Der Applikationsdruck betrug mit der Punktstrahldüse (Öffnung 120 μm) 30, 40 und 50 bar. Mit der Flachstrahldüse wurden mit Drücken von 70, 80 und 90 bar die Amnionmembranen kontinuierlich bestrahlt. Insgesamt 42 Gewebeproben wurden nach einer Nativfärbung mit Trypanblau am Lichtmikroskop untersucht; 14 Amnionproben, jeweils 2 pro Düsentyp und Applikationsdruckparameter, wurden rasterelektronenmikroskopisch analysiert, um die Effektivität der mechanischen Epithelabrasio von der Amnionmembran zu erfassen. Nach Bilddokumentation und histopathologischer Beurteilung wurde die Effektivität der mechanischen Epithelabrasio anhand einer Bewertungsskala evaluiert: 0 = keine Amnionepithelzellen, 1 = keine Zellen, wenig Zelltrümmer, 2 = einzelne Amnionepithelzellen, viel Zelltrümmer, 3 = aufgelockerter Amnionepithelzellverband, 4 = geschlossener Zellverband.

Ergebnisse

Mit dem Waterjet war einer „epithelzellfreie“ Oberfläche der Amnionmembran mit der Punktstrahldüse (Durchmesser: 120 μm) bei einem Druck von 30–50 bar zu erreichen. Bei Einsatz der Flachstrahldüse waren Applikationsdrücke von 70–90 bar notwendig.

Schlussfolgerungen

Die Bearbeitung von Amnionmembranen mittels Waterjet stellt eine präzise Möglichkeit dar, Amnionepithelzellen von der Amnionmembran mechanisch zu entfernen. Die ausschließlich mechanische Entfernung mit dem Wasserstrahlgerät ohne enzymatisch chemische Substanzen könnte vorteilhaft sein, da zytotoxische Effekte durch chemische Substanzen auf zu kultivierende limbale Stammzellen nicht auftreten.

Abstract

Background

Ex vivo culturing of limbal stem cells on human amniotic membranes can be accelerated if all amniotic epithelial cells have been removed beforehand. A common application of acellular amniotic membranes is their use in cultivating autologous oral mucosal epithelial cells for transplantation in cases of bilateral stem cell insufficiency. Amniotic epithelial cells can be eliminated with enzymatic-chemical or mechanical methods or with a combination of both.

Material and methods

The efficacy of a waterjet cutter to eliminate amniotic epithelial cells from the amniotic membrane was investigated. Deep frozen placentas from healthy mothers were defrosted and a well-defined surface of the amniotic membrane (d = 15 mm) was treated with the waterjet in a standardized way. The waterjet used two different nozzles (pin-point and narrow stream nozzles). The applied system pressures with the pin-point stream nozzle (aperture 120 μm) were 30, 40 and 50 bar and the narrow stream nozzle was operated with pressures of 70, 80 and 90 bar on the amniotic membrane. A total number of 42 tissue samples were examined with an optical microscope using native trypan blue staining. For each type of nozzle and each application pressure two amnion samples were examined with a scanning electron microscope to analyze the efficacy of the mechanical epithelial cell elimination from the amniotic membrane. After medical imaging and histopathological examination the efficacy was graded using the following scale: 0 = no amniotic epithelial cells, 1 = no cells, low amounts of cell debris, 2 = single amniotic epithelial cells, large amounts of cell debris, 3 = loose cell layer, 4 = continuous sheet of epithelial cells.

Results

To eliminate epithelial cells from the surface of the amniotic membrane with the waterjet pinpoint stream nozzle (aperture: 120 μm) an application pressure of 30–50 bar was needed. The use of the narrow stream nozzle required a pressure of 70–90 bar.

Conclusions

The preparation of amniotic membranes with the waterjet represents a precise option to mechanically eliminate amniotic epithelial cells from the amniotic membrane. The use of a waterjet cutter as an exclusively mechanical method without enzymatic-chemical substances may be a benefit, as cytotoxic effects on culturing limbal stem cells caused by chemical substances are not present.