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Spezielle labortechnische Reaktoren: Lab-on-a-Chip

  • Janina BahnemannEmail author
  • Frank StahlEmail author
  • Thomas ScheperEmail author
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Part of the Springer Reference Naturwissenschaften book series (SRN)

Zusammenfassung

Mikroreaktorsysteme ermöglichen es auf kleinstem Raum verschiedene Prozessschritte kombiniert ablaufen zu lassen. In diesem Kapitel werden die einzelnen funktionellen Einheiten solcher mikrofluidischen Systeme und deren Herstellungsverfahren – insbesondere die moderne, hochauflösende 3D-Drucktechnik – vorgestellt. Zudem werden Möglichkeiten und Restriktionen des Flüssigkeitstransports, der Durchmischung oder Auftrennung, der Etablierung von definierten Verweilzeit- und Reaktionsstrecken sowie der Integration von Sensoren in Lab-on-a-Chip Systeme aufgezeigt. Abschließend zeigen Beispiele aus der aktuellen Forschung, wie sich mikrofluidische Systeme für analytische Fragestellungen oder in der Bioprozesstechnik einsetzen lassen.

Schlüsselwörter

Mikrosystemtechnik Lab-on-a-Chip 3D-Druckverfahren Bioanalytik Bioprozesstechnik 

Einleitung

Die Mikrosystemtechnik macht es möglich, verschiedenste Prozessschritte auf kleinstem Raum miteinander zu kombinieren, so dass ein kontinuierlicher Ablauf möglich ist. Solche Systeme sind besonders für die Analytik interessant, da hier viele Analysenschritte automatisiert nacheinander ablaufen. Solche „Micro Total Analysis Systems“ (μTAS) werden allgemein als „Lab-on-a-Chip“ (LoC) bezeichnet. Für analytische Zwecke bieten sie den Vorteil, dass nur wenig Probe benötigt wird, geringe Kosten für den Reagenzverbrauch anfallen und dass auf kleinstem Raum die Analysenschritte parallelisiert ablaufen können, so dass die Analysengeschwindigkeiten erhöht werden. Interessant sind solche mikrofluidischen Systeme auch deshalb, da hydrodynamische Eigenschaften wie Flusssteuerung, Diffusionseigenschaften und Mischverhalten speziell auf die Analysenanforderungen angepasst werden können.

Mikrofluidische Systeme können aus Glas, Silizium, Polymeren oder auch Papier hergestellt werden. Papier-basierte Systeme, auch als μPAD (Microfluidic Paper-based Analytical Devices) bekannt, gelten laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als vielversprechender Ansatz für eine ressourcenarme Point of Care (PoC) Diagnostik, sollen hier jedoch nicht weiter behandelt werden. Der Fokus dieses Kapitels liegt auf der Darstellung von grundlegenden biologischen, chemischen und biotechnologischen Laborprozessen on chip mittels druckbetriebener Mikrofluidik sowie den theoretischen Grundlagen zur Strömung in mikrofluidischen Kanälen. Neben Druck können Fluide alternativ auch durch Kapillarkräfte, mittels Elektroosmose oder Zentrifugation bewegt werden.

Mikrofluidische Systeme sind durch laminare Strömung und somit eine hohe Fluidkontrolle gekennzeichnet. Aufgrund der geringen Kanaldurchmesser (deutlich unterhalb von 1 mm) steigt die Bedeutung von Diffusion für mikrofluidische Systeme. Da laminare Strömungsprofile eines geraden Kanals lediglich vertikale Stoffvermischung durch Diffusion zulassen, erfordern Mischmodule spezielle Designstrategien. Das hohe Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis mikrofluidischer Systeme führt zu signifikanten oberflächeninduzierten Effekten.

Zum einen ermöglicht die Fluidkontrolle mikrofluidischer Systeme die Generierung hochkontrollierter Reaktionsräume, in denen die Raumstruktur und Fließgeschwindigkeiten die Verweilzeit sowie das Mischen und Separieren bestimmen. Zum anderen erlaubt die Miniaturisierung von LoC-Systemen eine Verringerung von Probevolumen, Reagenzien und Abfallprodukten, sowie eine Verkürzung der Analysezeit, eine bessere Transportierbarkeit, Parallelisierbarkeit und Automation. Da Raum und Flussrate die Interaktion bestimmen, ist für die Automation keine teure Robotik notwendig. Allerdings wird in der Regel je nach Aufgabe bzw. Zielsetzung ein anderes LoC-Design benötigt.

Viele LoC-Systeme wurden anfänglich aus Glas hergestellt, jedoch setzten sich zunehmend Polymere wie PDMS (Polydimethylsiloxan) und das thermoplastische PMMA (Polymethylmethacrylat) als verbreitetste Baustoffe mikrofluidischer Systeme durch. Vorteile von PDMS sind zum einen die Möglichkeit zur Fertigung im Mikrometermaßstab sowie seine Biokompatibilität und Transparenz. Nachteile von PDMS sind hingegen, dass eine entsprechende Fertigung mikrofluidischer Systeme nicht automatisierbar ist, eine komplexe Reinraumausstattung und einen hohen Kenntnisstand des Experimentators erfordern. Eine vielversprechende Alternative stellen Fertigungsmethoden, wie hochauflösender 3D-Druck dar, die LoC-Systeme auch für weniger spezialisierte Labore zugänglich machen können.

In diesem Kapitel werden die Fertigung solcher mikrofluidischer Systeme, die Grundlagen aus Sicht der Technischen Chemie und Anwendungsbeispiele aus der Analytik vorgestellt.

Fertigungstechniken

Bisher wurden mikrofluidische Lab-on-a-Chip Systeme durch recht aufwendige Ätzverfahren und Fotolithografie im Reinraum hergestellt. Durch die Revolutionierung der 3D-Drucktechnik lassen sich heute selbst hoch komplexe Strukturen am Rechner designen und mit den entsprechenden additiven Druckverfahren aus Kunststoff oder Metall herstellen. Die Entwicklung von LoC-Systemen erfordert die Herstellung hochpräziser, feiner Strukturen, um Fluide gezielt bewegen und manipulieren zu können. Ideale Fertigungsspezifikationen ermöglichen die Verwendung verschiedener Materialien, eine schnelle und flexible Herstellung, geringe Stückkosten, eine hohe Auflösung sowie die Möglichkeit, diverse komplexe, dreidimensionale Strukturen zu generieren. Im Folgenden werden sowohl traditionelle als auch moderne, additive Fertigungstechniken erläutert.

Traditionelle Fertigungstechniken

Traditionelle Fertigungstechniken nutzen insbesondere das Polymermaterial PDMS aufgrund der vergleichsweise einfachen und günstigen Verarbeitung, der Biokompatibilität, Gaspermeabilität sowie der optischen Transparenz und elastomeren Materialeigenschaften (Bhattacharjee et al. 2016). Nachteilig ist die hohe Empfindlichkeit von PDMS gegenüber extremen pH-Werten und verschiedenen organischen Lösungsmitteln, die Quellen oder Erosion des Materials verursachen können. Die Herstellung eines Prototyps kann in vier Schritte unterteilt werden: die Herstellung einer Masterform, Guss und Aushärtung einer Schicht (weiche Lithografie), Assemblierung der Schichten (Bonding) und weiterführende Verarbeitungen, wie z. B. das Anbringen von Verbindungen und Anschlüssen.

Die Masterform wird mittels Fotolithografie hergestellt. Dabei wird ein UV-aushärtbarer Fotolack auf eine Siliziumplatte aufgebracht. Mit einer Fotomaske werden die Strukturen, die ausgehärtet werden sollen, gezielt bestrahlt und stellen damit das Negativ für den Guss dar. Diese Masterform ermöglicht die Herstellung von Strukturen in einstelliger Mikrometergrößenordnung. In die Masterform wird das Gemisch aus Monomer und Cross-Linking-Reagenz gegossen und bei hohen Temperaturen ausgehärtet. Dieser Vorgang ist als weiche Lithografie (soft lithography) bekannt. Nach erfolgreicher Polymerisation wird die Schicht abgelöst.

Die Verbindung der Schichten profitiert von den hohen gegenseitigen Wechselwirkungen von PDMS Schichten, die auf Van-der-Waals-Kräften beruhen. Die Stärke des Bondings kann durch eine Vorbehandlung mit Sauerstoffplasma deutlich verstärkt werden und auch die Bindung zu Glas über Si-O-Si-Vernetzung ermöglichen. Der anschließende Schritt der Assemblierung ist besonders fehleranfällig, bei geschlossenen Strukturen aber dringend notwendig. Für komplexere Strukturen, die über „2D mit Tiefe“ hinausgehen, muss eine Assemblierung von mehreren Materialschichten mit verschiedenen Mikrostrukturen erfolgen. Die korrekte Ausrichtung der Schichten untereinander ist entscheidend für die Entstehung dreidimensionaler Strukturen und erklärt, weshalb komplexere Designs nur eingeschränkt reproduzierbar sind. Der Assemblierungsschritt gibt die Möglichkeit, auf jeder Schicht weitere lokale Modifikationen des Materials vorzunehmen – beispielsweise durch Mikrokontakt oder Siebdruck (Abb. 1).
Abb. 1

Prinzip der Herstellung mikrofluidischer Strukturen in PDMS mittels Photolithographie und anschließendem Bonden an einen Glasträger

Anfänglich wurden zur Fertigung mikrofluidischer Systeme vor allem Glas und Silizium verwendet. Die Fertigung der einzelnen Schichten beruht auf der kombinierten Verwendung von Fotolithografie und chemischen Ätzverfahren. Der Assemblierungsschritt kann thermisch bei hohen Temperaturen erfolgen. Limitiert ist die Technik durch hochspezialisierte Fertigung, einen geringen Durchsatz und die Fragilität des Produkts, weshalb sich Glas als Fertigungsmaterial nicht durchgesetzt hat. Allerdings zeigt Glas seine Stärke im Hinblick auf chemische Stabilität und Inertheit.

Additive Fertigung

Als Additive Fertigung – besser als 3D-Druck bekannt – wird die Konstruktion eines dreidimensionalen Bauteils bezeichnet, das Schicht für Schicht aufgebaut wird und sich somit von subtraktiven Fertigungstechniken (subtractive manufacturing) unterscheidet. Mittels Computer-gestütztem Design (CAD, Computer Aided Design) wird ein dreidimensionales Modell erzeugt, welches im universell verwendeten STL-Format (Standard Tessellation Language) von einem 3D-Drucker verarbeitet wird. Dabei wird das Zielobjekt in eine endliche Anzahl an zu druckenden Schichten unterteilt. Die softwaregestützte Simulation von Fluiden in bestimmten Geometrien und in Abhängigkeit verschiedener Parameter (z. B. mittels COMSOL Multiphysics) ermöglicht dabei ein rationales Design (Au et al. 2016). Zu den 3D-Drucktechniken zur Herstellung von Lab-on-a-Chip Systemen gehören Stereolithografie (SLA, stereolithography), 3D-Tintenstrahldruck (PolyJet und MultiJetModeling) und der FDM-Druck (Fused Deposition Modeling), welche im Folgenden kurz vorgestellt werden.

Stereolithografie (SLA-Druck) basiert auf der selektiven Polymerisation durch einen Laser und ermöglicht die automatisierte Fertigung dreidimensionaler Strukturen. Polymerisiert werden bestimmte Oberflächenanteile einer Flüssigkeit. Die Flüssigkeit beinhaltet einen Fotoinitiator und Monomere, die in der Regel Acrylat- oder Epoxid-basiert sind und mittels Laserbehandlung auspolymerisiert werden (Parra-Cabrera et al. 2018; Waheed et al. 2016). Der Laser kann entweder direkt auf eine Stelle fokussiert werden oder durch DLP (digitale Lichtprojektion) simultan auf alle zu polymerisierenden Oberflächenanteile gerichtet sein. Nicht-polymerisierte Flüssigkeiten werden final ausgespült und können wiederverwendet werden. Insgesamt liegt die Auflösung im ein- bis zweistelligen Mikrometerbereich.

Neben Stereolithografie ermöglicht 3D-Tintenstrahldruck eine additive Fertigung für LoC-Systeme (Waheed et al. 2016). Analog zum klassischen Tintenstrahldruck wird beim 3D-Druckverfahren die „bildgebende“ Substanz thermisch oder piezoelektrisch durch einen Array an Düsen auf eine Plattform aufgetragen. Aufgrund seiner hohen Relevanz für die Mikrosystemtechnik wird im Folgenden ausschließlich auf das Fotohärten von Flüssigkeiten (häufig ein Gemisch aus Acrylaten und Fotoinititatoren), nicht aber auf pulverbasierte Verfahren eingegangen. Der Schicht-für-Schicht Aufbau von Tintenstrahldruck, wie u. a. im kommerzialisierten Polyjet Printing und MultiJet Modelling, nutzt einen Düsen-Array, der repetitiv Punkt für Punkt entweder das noch flüssige Material zur Bauteilgenerierung oder Stützmaterial aufträgt, welches anschließend durch eine UV-Lampe ausgehärtet wird. Das Stützmaterial, wie beispielsweise Wachs beim MultiJet Modelling, kann nach erfolgtem Druck bei erhöhter Temperatur in einem Wasser- und Ölbad abgetragen werden.

Trotz der aktuellen Beschränkung auf kommerziell erhältliche Materialien überzeugt 3D-Tintenstrahldruck durch eine schnelle Fertigung innerhalb weniger Stunden ohne Reinraumbedingungen, die Möglichkeit zur parallelen Fertigung verschiedenster Teile und komplexerer Strukturen sowie hohe Auflösungen im unteren zweistelligen Mikrometerbereich.

Bei dem FDM-Druck wird ein aufgeheiztes Thermoplastik durch eine heizbare Düse auf die Oberfläche aufgetragen (Bhattacharjee et al. 2016; Waheed et al. 2016). Sobald das Thermoplastik mit der Oberfläche in Kontakt kommt, kühlt das Thermoplastik ab und erstarrt. Dieser Vorgang lässt filamentöse Strukturen entstehen, die durch eine vergleichsweise geringe Auflösung, mechanische Instabilität sowie eine raue Oberfläche gekennzeichnet sind (Waheed et al. 2016). Um die Stabilität dieser Strukturen durch erhöhte Vernetzung der Filamente zu verbessern, können thermisch reversible Diels-Alder Reaktionen sowie Gammabestrahlung und eine Optimierung der Druckoberfläche genutzt werden. Überhangstrukturen werden durch unterstützende Strukturen ermöglicht. Hier sind Auflösungen unterhalb von 100 μm derzeit kaum möglich.

Beliebtheit erlangte FDM-Druck insbesondere durch geringe Anschaffungskosten sowie eine hohe Varietät verfügbarer Materialien. Verschiedene Thermoplastiken wie ABS (Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymer), PC (Polycarbonat) oder auch biokompatible Stoffe wie PLA (Polylactid), PCL (Polycaprolacton) oder der Polyester PBT (Polybutylenterephthalat) stehen zur Verfügung. Weitere Vorteile von FDM sind die schnelle Herstellung von Prototypen in wenigen Stunden, die Möglichkeit mehrere Materialien zu verwenden und den Fertigungsprozess zeitweise zu unterbrechen, um das Druckstück zu manipulieren (Hwang et al. 2018; Waheed et al. 2016). FDM ist insgesamt einfach durchzuführen und erfordert keinen Reinraum.

Grundlagen

Aus Sicht der Technischen Chemie handelt es sich bei Lab-on-a-Chip Systemen um miniaturisierte Reaktorsysteme mit Misch- oder Trenneinheiten, Reaktionsstrecken sowie Analyseeinheiten. Abb. 2 verdeutlicht dieses Prinzip. Ein solches LoC-System kann in Misch- und Verweilzeitstrecken, Reaktionsstrecken, Trennstrecken und Analysenstrecken aufgeteilt werden. Die jeweiligen funktionellen Einheiten übernehmen bei einer Analysenführung verschiedenste Aufgaben.
Abb. 2

Skizze eines Lab-on-a-Chip Systems bestehend aus mehreren funktionellen Einheiten: Proben- und Fluideingänge, Misch- und Verweilzeitstrecke, Reaktionseinheit (ggf. temperiert), Separations-/Trenneinheit

Die Miniaturisierung von Laboraufgaben im chemischen, biologischen und prozessanalytischen Aufgabengebiet bietet einige Vorteile: Zum einen ermöglichen stark verringerte Mengen an Probe, Chemikalien und Abfallprodukten eine Kostenersparnis. Zum anderen ermöglicht die Aneinanderreihung der Laborschritte auf einem Chip eine Zeitersparnis, die Reproduzierbarkeit von Versuchen sowie deterministisches Strömungsverhalten und Automatisierung. So wird ermöglicht, dass das Zusammenbringen und Mischen sowie die Reaktion, Inkubation und Separation von Substanzen in kontrollierter Mikroumgebung und Zeit stattfinden.

Die Fluidführung in einem solchen System erfolgt durch Mikropumpen oder extern arbeitende pulsationsfreie Kolbenpumpen. Dies wird im Folgenden dargelegt, genauso wie die Möglichkeiten des Fokussierens oder Trennens von nieder- und hochmolekularen Substanzen durch gezielte Beeinflussung der Strömungsverhältnisse.

Strömungsverhalten

Generell kann beim Transport in mikrofluidischen Systemen zwischen „gerichtetem Transport“ und „statistischem Transport“ unterschieden werden. Während der gerichtete Transport von äußeren Kräften abhängig ist und unterschiedliche Strömungsprofile (meist laminar) aufweist, ist der ungerichtete, statistische Transport hauptsächlich auf diffusiven Transport, beispielsweise durch Konzentrationsunterschiede, zurückzuführen. Gemischte Transportvorgänge können auch durch Überlagerung von Temperaturgradienten mit einem gerichteten Transport hervorgerufen werden. So kann der gerichtete Fluss parallel zur Oberfläche erfolgen während orthogonal dazu ein Temperaturgradient existiert, der die Moleküldiffusion beeinflusst. In realen Systemen ist es jedoch nicht möglich, einen rein gerichteten oder einen rein statistischen Transport aufrecht zu erhalten. Dispersive Kräfte sind auch hier, wie in der Reaktortechnik, je nach Bauweise und Betriebsweise zu beobachten. Dennoch kann, wie später zu sehen sein wird, gerade die gezielte Beeinflussung der Transportvorgänge interessante Eigenschaften der mikrofluidischen Systeme hervorrufen. In der Mikrofluidik spielen andere physikalische Gesetze und Effekte eine Rolle als in der Makrofluidik. Dabei gilt: Je kleiner das mikrofluidische System, desto größer ist das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen. So nimmt beispielsweise mit abnehmenden Kanaldimensionen der Einfluss der Reibungskräfte gegenüber den Trägheitskräften zu. Aus diesem Grund liegen in der Mikrofluidik in der Regel laminare Strömungen vor. Gleichzeitig haben Diffusionskräfte sowie Wandeffekte (z. B. Wandreibung) eine größere Bedeutung als im makroskalierten Fluidtransport. Oberflächenladungen und Kapillarkräfte dominieren über die Gravitation und ermöglichen einen rein passiven Flüssigkeitsantrieb, der u. a. auch in Lateral-Flow-Assays (z. B. Schwangerschaftstest) genutzt wird. Aufgrund der laminaren Strömung ergibt sich keine chaotische Durchmischung, so dass stabile Grenzflächen zwischen Flüssigkeitsfäden entstehen und eine Vermengung von Substanzen rein abhängig von der Diffusion ist. Die Diffusion wird wiederum durch die geringen Distanzen innerhalb des Kanals begünstigt.

Das Gesetz von Hagen-Poiseulle stellt eine zentrale Gleichung für mikrofluidische Systeme dar, indem es den Volumenstrom \( \frac{dV}{dt},\mathrm{die}\ \mathrm{Druckdifferenz}\ \Delta \mathrm{p},\mathrm{die}\mathrm{Kanall}\ddot{\mathrm{a}}\mathrm{nge}\, l,\mathrm{die}\, \mathrm{Viskosit}\ddot{\mathrm{a}}\mathrm{t}\, \upmu \, \mathrm{und}\, \mathrm{den}\, \mathrm{Kanalradius}\, r \) zueinander in Beziehung setzt. Die Hagen-Poiseulle Beziehung gilt für eine mittels Druckdifferenz getriebene laminare Strömung eines newtonschen Fluids. Eine Bedingung, die auch für weitere explizite Lösungen genutzt wird, ist die Haftbedingung der Strömungsmechanik (no-slip condition) (Bruus 2011). Diese nimmt an, dass die Strömungsgeschwindigkeit an den Wänden des Kanals Null entspricht. Nach Hagen-Poiseulle ergibt sich damit eine parabolische Verteilung der Strömungsgeschwindigkeit, wobei die maximale Strömungsgeschwindigkeit im Zentrum des Kanals ist. Eine laminare Strömung zeichnet sich zudem durch parallel fließende Fluidelemente aus, sodass angesichts fehlender Turbulenzen die Durchmischung des Fluids ausschließlich durch Diffusionskräfte erfolgt. Die Berechnung der Druckdifferenz ist dabei beispielsweise für die Berechnung der Fluidverteilung in einem verzweigten Kanalsystem von Bedeutung.

Dimensionslose Kennzahlen werden genutzt, um Eigenschaften eines Systems zu vergleichen, wobei die Reynoldszahl Re, die Pécletzahl Pe und die Deanzahl De für die Beschreibung druckbetriebener, mikrofluidischer Systeme am wichtigsten sind (Zhang et al. 2016).

Die Reynoldszahl Re beschreibt die Neigung eines Systems, laminare oder turbulente Strömung aufzuweisen und berechnet sich aus dem Verhältnis von Trägheitskräften und Viskosität (Bruus 2011).
$$ \mathit{\operatorname{Re}}=\frac{\rho\ u\ {D}_H}{\mu } $$

Typische Größen eines mikrofluidischen Systems mit einem hydraulischen Durchmesser DH von 150 μm, einer wässrigen Lösung als Fluid (ρ ~ 1000 kg/m3 und μ ~ 0,001 Pa s), sowie einer Fließgeschwindigkeit u von 100 μl/min, resultieren in einer Reynoldszahl von deutlich kleiner Eins. Reynoldszahlen unterhalb von 2300 werden allgemein in Rohrströmungen als laminar angenommen, sodass keine Turbulenzen in einem geraden Kanal zu erwarten sind. Bei Re größer als 2300 wird die Strömung als turbulent bezeichnet (Amini et al. 2014).

Die Pécletzahl Pe beschreibt den Stofftransport in einem System und ist dabei proportional zur Fließgeschwindigkeit und dem hydraulischen Durchmesser und antiproportional zum Diffusionskoeffizienten. Damit stellt die Pécletzahl Pe das Verhältnis von Konvektion und Diffusion dar und gibt das zur vollständigen Durchmischung benötigte Verhältnis von Kanallänge und Kanalbreite an.
$$ Pe=\frac{v\ d}{D} $$

Dabei ist v die Geschwindigkeit, d die charakteristische Länge des mikrofluidischen Systems und D die Diffusionskonstante. Die geringen Größen eines mikrofluidischen Systems betonen dabei die Bedeutung der Diffusion. Es ist dabei aber zu beachten, dass der Diffusionskoeffizient eine stoffabhängige Größe ist (Zhang et al. 2016).

Für gekrümmte Kanäle ergeben sich sekundäre Fluidverläufe, die als Dean-Wirbel bekannt sind. Zwei zueinander entgegengesetzt rotierende Wirbel sind das Resultat eines Druckgradienten. Das schnellere und damit trägere Fluid im Kanalzentrum bewegt sich nach außen. Die höhere Geschwindigkeit im Kanalinneren ergibt sich aus dem laminaren Strömungsprofil (Amini et al. 2014). Damit sinkt der Druck in der Innenseite des Kanals, so dass sich das innenliegende Fluidvolumen trotz seiner geringen Geschwindigkeit nach außen bewegt. Die Neigung zur Wirbelbildung wird mittels der dimensionslosen Dean-Kennzahl De beschrieben, die von der Reynoldszahl Re, dem hydraulischen Durchmesser DH und dem Radius R der Kurve abhängig ist:
$$ De=\mathit{\operatorname{Re}}\ \sqrt{\frac{D_H}{2R}} $$
Abb. 3

Trägheitskräfte in einem mikrofluidischen Kanal (a) Auf Partikel in zweidimensionalen Kanälen wirken gegensätzliche Kräfte ein: Schergradient der Auftriebskraft (FSL) und die wandabhängige Auftriebskraft (FWL) (b) Dean-Kräfte erzeugen zwei gegensätzlich rotierende Wirbel (weiße Pfeile); rote Pfeile zeigen die Kräfte, die auf die Partikel wirken (1: nur Dean-Kräfte; 2: Auftriebskraft plus Dean-Kräfte; 3: Auftriebskraft minus Dean-Zugkraft; 4: nur Dean-Kräfte). (c) Quadratische Kanäle bewirken vier Gleichgewichtspositionen für Partikel (mittig der Kanten) (d) Rechteckige Kanäle verschiedener Kantenlänge bewirken zwei Gleichgewichtspositionen für Partikel (mittig der langen Kanalkanten)

Entgegen intuitiver Annahmen einer gleichmäßigen Verteilung von Partikeln in einem mikrofluidischen System, nehmen Partikel Gleichgewichtspositionen ein: Bei einem quadratischen Kanalquerschnitt ergeben sich dabei vier, bei einem rechteckigen Querschnitt unterschiedlicher Kantenlänge, zwei stabile Gleichgewichtspositionen. Der Abstand der Partikel von der Wand ist dabei abhängig von der Größe der Partikel und dem hydraulischen Durchmesser (Amini et al. 2014; Wang und Dandy 2017). Das Gleichgewicht ergibt sich aus dem Schergradienten der Auftriebskraft (shear gradient lift force (FSL)) und der wandabhängigen Auftriebskraft (wall-effect lift force (FWL)). FSL drückt Partikel vom Kanalzentrum zur Wand, da in einem laminaren Strömungsprofil die maximale Strömungsgeschwindigkeit im Kanalzentrum liegt (siehe Abb. 3). FWL hingegen stößt Partikel aufgrund der Interaktion zwischen Wand und Partikel von der Wand ab. Die Nettoauftriebskraft FL, die das Zusammenspiel beider Kräfte abbildet, ergibt sich aus der Dichte ρ, der maximalen Strömungsgeschwindigkeit Um, dem Partikeldurchmesser a, dem hydraulischen Durchmesser DH und einem Auftriebskoeffizienten fc (lift coefficient):
$$ {F}_L=\frac{\rho\ {U}_m^2\ {a}^4}{D_H^2}\ {f}_c $$
Obwohl sie für ihre mischende Wirkung bekannt sind, können eine vorsichtige Justierung der Dean-Wirbel und der netto Auftriebskraft eine Fokussierung von Partikeln an einem einzigen Gleichgewichtspunkt bewirken (Amini et al. 2014; Wang und Dandy 2017). Dieses Phänomen kann als Trennmöglichkeit von Partikeln in Mikrokanälen genutzt werden. Rf bezeichnet das Verhältnis der Auftriebskraft zur Dean-Zugkraft (die auf den Dean-Wirbeln beruhende Kraft) und kann als Abschätzung genutzt werden, ob eine Gleichgewichtsposition von Partikeln eingenommen wird. Nach Di Carlo soll Rf > 0,04 sein; dabei entspricht a dem Partikeldurchmesser, R dem Durchmesser der Kurve und h der geringsten Kanaldimension:
$$ {R}_f=\frac{a^2\ R}{h^3}>0,04 $$

Rf -Werte, die gegen Null tendieren, lassen erwarten, dass die Partikel den Dean-Wirbel nicht verlassen, während bei großen Rf-Werten zu erwarten ist, dass die Partikel die Gleichgewichtspositionen eines geraden Kanals einnehmen. Rf kann prinzipiell so gewählt werden, dass bestimmte Partikel eine Gleichgewichtsposition im Kanalquerschnitt einnehmen und andere nicht. Das Zusammenspiel von Dean-Wirbeln, dem Schergradienten der Auftriebskraft FSL und der wandabhängigen Auftriebskraft FWL werden z. B. bei Anwendungen mikrofluidischer Partikelseparatoren ausgenutzt.

Fluidkontrolle

Für den Transport von Flüssigkeiten durch mikrofluidische Systeme werden unterschiedliche physikalische und chemische Prinzipien, wie z. B. Kapillarkräfte, Konvektion und elektroosmotische Effekte genutzt. Die vielfältigen Möglichkeiten, Strömungen in der Mikrofluidik aktiv zu nutzen, sollen an einigen Beispielen gezeigt werden. So lassen sich Probenströme hydrodynamisch fokussieren, indem Hüllströme eingeführt werden (siehe Abb. 4). Dies kann z. B. zum Vereinzeln von Zellen aus Zellsuspensionen genutzt werden (siehe auch Durchflusszytometrie). In den fokussierten Stromfäden fließen dann die Zellen nacheinander wie Perlen an einer Perlenkette.
Abb. 4

Hydrodynamische Fokussierung eines Probenstroms im mikrofluidischen System

Eine Möglichkeit zur gezielten Fluidkontrolle ist der Einsatz von Mikroventilen und Mikropumpen, wie sie in mikroelektromechanischen Systemen (MEMS) genutzt werden. Mikroventile kontrollieren den Fluidstrom insofern, als dass sie den Kanal an manchen Stellen für das Fluid unpassierbar machen. Für Mikroventile bietet es sich an, flexible Komponenten, wie z. B. Mikrokugeln oder Membranen zu verwenden, so dass durch die Anpassung des Mikroventils an die Kanalstruktur eine gewünschte Dichtigkeit erzeugt wird. Das Ventil kann durch den Druck des Fluids geöffnet oder geschlossen werden. Es ist zudem möglich, einen Kanal mittels Druckluft auf der Gegenseite der Membran zu verschließen.

Mikropumpen stellen eine weitere Möglichkeit zur mikrofluidischen Flusskontrolle dar. Aktive Mikropumpen nutzen eine Vielzahl von Effekten wie Elektroosmose, Magnetohydrodynamik (Lorentzkraft) oder Elektrolyse (Antrieb durch Gasblasenentwicklung). Zudem können oszillierende Membranen verwendet werden, die nacheinander mit Druckluft angesteuert werden und somit ein frequentiertes Verdrängen eines Volumens ermöglichen (Lee et al. 2018; Zhang et al. 2007).

Die Aufteilung eines Fluidstroms in unterschiedliche Strömungsfäden lässt sich in verzweigten Systemen ermöglichen. Da der Volumenstrom im jeweiligen Kanalabschnitt die einzige veränderbare Größe ist, verteilen sich die Flüsse im verzweigten Kanalsystem so, dass der Gesamtwiderstand minimiert wird. Dabei ergeben sich interessante Einsatzmöglichkeiten, z. B. die Herstellung von Mikromischern zur Erzeugung definierter Gradienten, wie es in Abb. 5 gezeigt wird.
Abb. 5

Beispiel eines 3D-gedruckten Gradientenmischers im Weihnachtsbaumformat. a: 3D-CAD-Design, b: 3D-gedruckter Gradienten-Mikromischer (Fotografie von Eberhard Franke (www.eberhardfranke.com)), c: Prinzip des Gradienten-Mikromischers am Beispiel vom pH-Wert

Im folgenden Abschnitt wird auf verschiedene Varianten mikrofluidischer Mischmodule, Reaktionskammern und Separationsmodule detaillierter eingegangen.

Mikrofluidische Mischer

Da in mikrofluidischen Systemen hauptsächlich laminare Strömungsverhältnisse vorliegen, müssen spezielle Mischeinheiten benutzt werden, um Reaktionskomponenten effizient miteinander zu vermischen. Es sind diverse Arten von Mikromischern bekannt, bei denen man prinzipiell zwischen aktiven und passiven Mischern unterscheidet. Ein Beispiel eines passiven Mikromischers stellt der sogenannte T-Mischer dar (siehe Abb. 6).
Abb. 6

Beispiel eines passiven mikrofluidischen T-Mischers; Mischvorgang beruht auf Diffusion

Passive Mischer nutzen lediglich die durch Pumpen erzeugte Bewegung der Flüssigkeiten, um eine Mischung herbeizuführen. Hierbei werden die Ströme durch die Kanalkonstruktionen so manipuliert, dass die Durchmischung beschleunigt wird. Capretto et al. teilen passive Mischer in sechs Kategorien ein: T- oder Y-Form, Parallele Strömung, Split-and-Recombine (SAR), fokussierende Strömung, chaotische Advektion und Tröpfchen-Mischer (Capretto et al. 2011) (Abb. 7). In einem T- oder Y-Mischer fließen die zu mischenden Flüssigkeiten einfach in einem Kanal zusammen. Diese Mischerart ist sehr simpel zu konstruieren, allerdings führt lediglich die Diffusion über die Kanalbreite zur Durchmischung (Abb. 6). Daher sind T- und Y-Mischer sehr ineffizient.
Abb. 7

Beispiel vier passiver Mikromischer. a: Y-Mischer (Diffusion), b: Mikrorillen im Kanal (z. B. Staggered Herringbone Mischer), c: F-Mischer (Split-and-Recombine), d: Tesla-like Mischer (Chaotische Advektion)

Mischer, die eine parallele Strömung nutzen, teilen die Flüssigkeitsströme erst auf (ähnlich zu Abb. 5) und führen sie dann wieder zusammen. Verschiedene Varianten werden genutzt. Eine Spezialform dieser Mischer ist der Split-and-Recombine Mischer. In diesen Mischern werden die Flüssigkeitsströme in jedem Mischelement in zwei Kanäle aufgetrennt. Aus zwei parallelen Strömen im Eingangskanal werden je zwei in jedem Verzweigungskanal. Die Kanäle werden dann wieder zusammengeführt, so dass jetzt vier dünne Strömungsschichten parallel nebeneinander fließen. Mit weiteren Mischeinheiten steigt die Zahl der immer dünner werdenden Flüssigkeitsschichten exponentiell an. Die Diffusionsstrecken werden immer kleiner und eine effektive Durchmischung kann erreicht werden.

Fokussierende Mischer nutzen ebenfalls parallele Strömungen aus. Das Prinzip ist schon in Abb. 4 für die hydrodynamische Fokussierung von Teilchenströmen vorgestellt. Durch die Fokussierung des inneren Stroms wird die durch Diffusion zu überwindende Distanz stark verringert. In dem fokussierten Strömungsfaden kann eine schnelle Durchmischung erfolgen. Die Mischeffizienz dieses Mischers ist sehr stark von dem Unterschied der Fließgeschwindigkeiten von inneren und den äußeren Strömen abhängig.

Mischer, die auf dem Prinzip der chaotischen Advektion beruhen, zielt auf die Einführung chaotischer Strömungsbewegungen ab. Advektion beschreibt den Transport einer Substanz in einem strömenden Medium, welcher in Mikrokanälen normalerweise in Richtung der laminaren Strömung erfolgt. Als chaotische Advektion wird der Transport ähnlich der turbulenten Strömung in alle Richtungen der Mikrokanäle bezeichnet. Genutzt werden können unter anderem sich wiederholende Widerstände (z. B. Herringbone-Strukturen, ähnlich den statischen Mischern) oder gekrümmte Kanäle, um Dean-Wirbel zu induzieren. Zudem ist es möglich, verschiedene Mischertypen zu vereinen und so sowohl Split-and-Recombine als auch chaotische Advektion nutzbar zu machen.

Aktive Mikromischer nutzen (zusätzlich) externe Energiequellen, um eine schnellere Durchmischung zu ermöglichen. Externe Energiequellen umfassen Ultraschall, Temperatur, Magnetismus und Druck. Die Implementierung aktiver Mischer in ein mehrstufiges LoC-System ist allerdings meist schwierig. Zusätzlich können die genutzten Energiequellen einen negativen Einfluss auf die zu mischenden Substanzen haben (z. B. bei lebenden Zellen und biologischen Proben), weshalb sie vor allem bei biologischen Anwendungen selten eingesetzt werden.

Reaktions- und Inkubationskammern

Mithilfe mikrofluidischer Systeme können hochkontrollierbare Reaktionsräume erstellt werden. Besonders für Reaktionen, die nach einer exakt definierten Zeit beendet, die bei konstanten Temperaturen (auch exotherme Reaktionen) ablaufen müssen oder über den gesamten Zeitraum überwacht werden sollen, kann der Einsatz von Mikrosystemen von großem Vorteil sein. Die Inkubations- bzw. Verweilzeit in solchen Systemen wird durch das LoC-Design (z. B. Länge der Inkubationskammer) und die gewählten Flussraten exakt festgelegt und kann für verschiedene Reaktionen entsprechend angepasst werden.

Aufgrund der Miniaturisierung kann der Reaktions- bzw. Inkubationsraum an gewünschter Stelle homogen temperiert werden. Das gute Verhältnis von Oberfläche zu Reaktionsvolumen erlaubt eine einfache und genaue Thermostatisierung. Durch die geringen Abstände innerhalb der Mikrokanäle kann die Temperatur mit externen Kühl- und Heizelementen (z. B. Peltier-Elementen) gesteuert werden, wie es beispielsweise bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) genutzt wird. Des Weiteren kann die Reaktion durch das Einbringen eines weiteren Reagenzes oder die Änderung der Temperatur nach definierter Zeit schnell beendet werden.

Ein weiterer Vorteil von LoC-Systemen ist, dass das Produkt einer Reaktion durch integrierte Sensoren (siehe Analytik) unmittelbar (online) gemessen werden kann. LoC-Systeme ermöglichen zudem die Parallelisierung von Reaktionen, was für Screening-Prozesse und die Prozessoptimierung genutzt werden kann. Abb. 8 zeigt das Prinzip einer mikrofluidischen Reaktions- und Inkubationseinheit.
Abb. 8

Beispiel einer mikrofluidischen Reaktions-/Inkubationseinheit. Die gewünschten Reagenzien werden über Pumpen zusammengeführt, in einem Mikromischer gemischt und direkt in die temperierte Reaktionseinheit (mit definierter Verweilzeit) geleitet. Im Anschuss erfolgt das Abstoppen der Reaktion (z. B. durch chemisches Quenchen/Stoppen der Reaktion), sowie die Produktanalytik

Mikrofluidische Separatoren

Die Trennung von Partikeln oder Zellen voneinander oder vom Reaktionsmedium ist ein häufig vorkommender Prozess in der Mikrofluidik und stellt ein wichtiges Instrument labortechnischer Aufgaben dar. Mikrofluidische Separatoren werden beispielsweise genutzt, um eine Probenflüssigkeit zu reinigen oder Probenbestandteile zu separieren (z. B. Blutbestandteile) und genauer zu untersuchen. Hierbei unterscheidet man prinzipiell zwischen aktiven und passiven Separatoren. Als aktive Separation werden Techniken bezeichnet, die ein externes Kraftfeld (z. B. elektrisches Feld) nutzen, während passive Separation ausschließlich das Fluidverhalten in einem Mikrokanal zum Trennvorgang zunutze macht.

In Abb. 9 wird gezeigt, wie gerichteter und ungerichteter Transport in einer Art Filtersystem genutzt werden. Während der Aufnahmepuffer und die farbstoffhaltige Trübe mit Partikeln in einem laminaren Betrieb zusammengeführt werden und sich kaum mischen, können die Farbstoffpartikel durch Diffusion orthogonal zur Strömungsrichtung in den Aufnahmepuffer wandern. Im Ausgangsbereich erhält man einen partikelhaltigen Strom aus dem der Farbstoff abgereichert wurde und einen Pufferstrom in dem der Farbstoff durch Diffusion angereichert wurde.
Abb. 9

Beispiel eines mikrofluidischen Filtersystems/Separation von Partikeln

Die Anwendung von Separationsmethoden ist neben der Trennung von verschiedenen Komponenten auch eng verwandt mit Aufkonzentrierung. Die Aufkonzentrierung von Proben erfolgt im klassischen Labor mittels Zentrifugation, eine Methode, die üblicherweise diskontinuierlich angewandt wird und limitierend hinsichtlich ihrer Reproduzierbarkeit ist. Die Verwandtschaft von Separation und Konzentration zeigt sich durch die Verwendung von mikrofluidischen Fokussierungstechniken, wie sie auch für die passive Separation beschrieben sind. Mithilfe der Zellfokussierung ergeben sich zellfreie Volumina, die abgetrennt werden können. Mikrofluidische Aufkonzentrierung ist verglichen mit der Zentrifugation von Zellen vielversprechend hinsichtlich erhöhter Zellviabilität, kontinuierlicher Arbeitsweise und Reproduzierbarkeit.

Passive mikrofluidische Separatoren nutzen die Wechselwirkung zwischen den Partikeln, dem Strömungsfeld und der Geometrie der Mikrokanäle und den in diesen herrschenden Trägheitskräften und Dean-Wirbeln aus. Zu den passiven Trennverfahren gehören beispielsweise das Deterministic Lateral Displacement (DLD), die hydrodynamische Fokussierung (siehe oben), Mikrofiltration oder Pinched Flow Fractionation.

Wie bereits im Abschnitt Grundlagen eingegangen, ergeben sich für Partikel nach genügend langer Zeit und Strecke in einem geraden, mikrofluidischen Kanal mit rechteckigem Querschnitt zwei oder vier Gleichgewichtspositionen (Amini et al. 2014). Neben einer Verringerung der erforderlichen Fokussierungsstrecke, bietet die Anwendung von Dean-Wirbeln eine Reduzierung auf eine einzige Gleichgewichtsposition. Dabei ist allerdings eine vorsichtige Justierung nötig, in der je nach Partikelgröße die Kanalgeometrie, Flussrate und Mindestlänge des Systems beachtet werden müssen. Dies dient dazu sicherzustellen, dass die Dean-Wirbel ausreichend stark sind, um die Partikel von den Gleichgewichtspositionen eines geraden Kanals zu entfernen. Dabei dürfen die Wirbel jedoch nicht so stark sein, dass Vermischungseffekte dominieren und somit die Einnahme einer Gleichgewichtsposition verhindern. Neben der direkten Fraktionierung des Kanalinhalts, kann auch eine massive Expansion der Kanalbreite genutzt werden, um prefokussierte Partikel weiter aufzutrennen (Wang und Dandy 2017).

Die Anwendung von Trägheitskräften und Dean-Wirbeln kann im weitesten Sinne in die Verwendung von Spiralseparator- und Serpentinstrukturstrategien unterteilt werden. Spiralseparatoren zeichnen sich durch eine monotone Orientierung der Kurve aus und damit einer gleichmäßigen Wirkung der Kräfte. Spiralseparatoren wurden bereits häufig eingesetzt, wie z. B. zur Separation von subzellulären Bestandteilen oder tierischen Zellen, wie z. B. zirkulierende Tumorzellen (CTC) oder CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary). Abb. 10 zeigt das Prinzip eines mikrofluidischen Spiralseparators zur Trennung von Partikeln oder Zellen unterschiedlicher Größe.
Abb. 10

a) Prinzip eines mikrofluidischen Spiralseparators für die Trennung von Partikeln oder Zellen unterschiedlicher Größe. b) Der Kanalquerschnitt zeigt das Gleichgewicht zwischen den auf die Partikel wirkenden Kräften: Auftriebskraft (FH) und Dean-Kräften (FZ)

Im Gegensatz zu den Spiralseparatoren weisen Serpentinenseparatoren wechselnde Kurvenorientierungen auf. Die Serpentinen können hierbei symmetrisch, asymmetrisch, eckig oder abgerundet sein. Eine Möglichkeit auch größere Mengen einer Probe zu fraktionieren, ist die Parallelschaltung von Serpentinen. Mikrofluidische Serpentinenstrukturen wurden beispielsweise genutzt, um Blutzellen oder Bakterien zu isolieren. Einen Einfluss darauf, ob Partikel innen oder außen eines rechteckigen Kanals fokussiert werden, haben Partikelgröße und Reynoldszahl. Größere Partikel nehmen bei erhöhten Reynoldszahlen zentral im Kanal Gleichgewichtspositionen ein, während kleinere Partikel an den Außenwänden des Kanals fokussiert werden (Zhang et al. 2014).

Aktive Separatoren sind in der Regel effektiver als passive Methoden, benötigen jedoch externe Felder. Während der gerichtete Transport hauptsächlich auf konvektiven Kräften (z. B. durch Pumpen) beruht, kann z. B. auch durch akustische, optische oder elektrische Felder ein gerichteter Transport und somit eine aktive Separation hervorrufen werden. Wenn man elektrische Felder verwendet, spricht man von einem elektroosmotischen Fluss. Hier ist es möglich zwei gerichtete Transportvorgänge zu überlagern. Während der Flüssigkeitsstrom in eine Richtung zielt, kann der elektroosmotische Fluss einzelne geladene Teilchen in eine andere Richtung bewegen (Abb. 11). Ein Probenstrom, der anionisch und kationisch geladene Teilchen beinhält, wird in der Mitte des Systems zugeführt. Durch gezielte Flussführung können je nach Ausrichtung des elektrischen Feldes die geladenen Teilchen aufgetrennt werden.
Abb. 11

Beispiel einer aktiven Partikelseparation mittels elektroosmotischem Fluss

Elektrophoresen werden genutzt, um Komponenten mit verschiedener elektrophoretischer Mobilität in einem elektrischen Feld zu trennen. Verschiedene Elektrophoresevarianten wurden bereits erfolgreich miniaturisiert, zu denen auch die isoelektrische Fokussierung gehört (Nagel 2018). Eine kontinuierliche mikrofluidische Elektrophorese ist gewöhnlich aus einer Separationskammer, einem Bereich für die Elektroden sowie meist mehreren Zu- und Ausgängen zwecks Fraktionierung aufgebaut. Die Miniaturisierung zeigt für elektrophoretische Prozesse einige Vorteile, wie z. B. kurze Migrationswege, schnelle Separation, hohe elektrische Felder bei geringeren Spannungen und die stabilisierende Wirkung laminarer Strömung auf die Trennung (Herzog et al. 2016).

Anwendungen und Prozessbeispiele

Die Kombination von mikrofluiden und mikroelektronischen Instrumenten auf einem LoC-System ermöglicht Analysen unter minimalem Substratverbrauch und in Echtzeit. Im Idealfall sollten alle Schritte der Analyse wie Probenvorbereitung, Reaktion, Perfusion, Separation, Reagenzienentfernung und Auswertung auf dem Chip durchführbar sein. Da die Applikationen auf LoC-Systemen extrem vielfältig sind und von der Umweltanalytik über die pharmazeutische Substanztestung bis zur patientenspezifischen PoC-Diagnostik reichen, sollen in diesem Kapitel die Anwendungen exemplarisch auf der Detektion markierter und unmarkierter Analysenpartner beschränkt bleiben und zugehörige Anwendungen exemplarisch beschrieben werden.

Üblicherweise nutzt man die Fluoreszenzdetektion aufgrund ihrer hohen Sensitivität in mikrofluidischen LoC-Systemen, insbesondere im Hinblick auf geringste Analytmengen und kleine optische Schichtdicken. Dies funktioniert nur, wenn die Analyten vorher mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden, was oft mit Nachteilen verbunden ist, da sich die Analytstruktur ändern kann. Die Detektion von Hybridisierungsereignissen zwischen einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül und dem Target kann in flüssigen Medien z. B. mittels des sogenannten TIRF-Prinzips (Total Internal Reflection Fluorescence) durchgeführt werden, da eine Auflichtbeleuchtung hier nicht sensitiv genug ist. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgt dann über das evaneszente Feld einer im Chipsubstrat geführten optischen Welle. Durch Totalreflexion eines Laserstrahls über die Detektionsfläche des Chips wird ein evaneszentes Feld für die Anregung von Fluorophoren erzeugt und das emittierte Fluoreszenzlicht auf einer CCD-Kamera (Charge-coupled Device) abgebildet. Aufgrund der geringen Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in den Fließkanal des Chips werden nur Fluorophore in unmittelbarer Nähe der Oberfläche angeregt, wodurch die Messung der Hybridisierungsereignisse an den Fängermolekülen sehr schnell erfolgt, da auf Waschschritte verzichtet werden kann. Gleichzeitig ist mit dieser Methode die Aufnahme der Kinetik der biochemischen Reaktionen möglich. Die Nachweisgrenze liegt im Bereich weniger pmol/l. (Ozhikandathil und Packirisamy 2012). Inzwischen kann durch die Anwendung kurzwelliger UV-Laser die Fluoreszenzmarkierung substituiert werden. Dazu müssen die eingesetzten Chipmaterialien UV durchlässig sein.

Markierungsfreie Messungen basieren meist auf massenspektrometrischen oder elektrischen bzw. elektrochemischen (Krogmeier et al. 2007; Wu und Chen 2005). Detektionsverfahren. Neuerdings werden auch Techniken, wie z. B. Raman-, Infrarot- oder die NMR-Spektroskopie an Mikrofluidik Systeme gekoppelt (Viskari und Landers 2006). Verbreitete elektrochemische Methoden sind Mikro-Multielektroden Arrays (MMEAs), die Amperometrie, die Voltametrie und die Konduktometrie. So wird in der Amperometrie der notwendige Strom zur Umsetzung redoxaktiver Spezies betrachtet und in der Konduktometrie der elektrische Widerstand. Der elektrische Widerstand ändert sich, sobald Analytmoleküle ins Detektionsvolumen eintreten. Elektrochemische Messmethoden sind aufgrund des geringen instrumentellen Aufwands kostengünstiger als die Fluoreszenzdetektion, benötigen allerdings Elektroden, welche sich jedoch verhältnismäßig einfach in die Chipfertigung integrieren lassen.

Goldnanopartikel lassen sich sowohl zur optischen als auch zur elektrischen Detektion einsetzen. Mit Goldnanopartikeln markierte Proben binden an immobilisierte Fängermoleküle in Elektrodenspalten und führen im Fall einer spezifischen Bindung über eine anschließende Silberverstärkung zu einem elektrischen Signal, dass leicht detektierbar ist (Reichert et al. 2000). Hierbei führt abgeschiedenes Silber zu einer Überbrückung des Elektrodenspalts und damit zu einem Abfall des elektrischen Widerstandes, der gemessen werden kann.

Mittels konfokaler Raman-Mikroskopie können Funktionsanalysen von Proteinen, Peptiden und Aminosäuren durchgeführt werden, auch unter Zuhilfenahme von Molekülresonanzen zur Signalverstärkung oder in direktem Zusammenspiel mit der Resonanz- Raman- Spektroskopie. Kombiniert man Raman-Spektroskopie mit Mikroskopie, lassen sich Strukturen abbilden, die kleiner als ein Mikrometer sind. Durch die hohe räumliche Auflösung erhält man neben dem spezifischen Raman-Spektrum auch eine optische Abbildung der untersuchten Probe auf Einzelzellniveau.

Multielektroden Arrays (MEAs) werden für elektrisch aktive Zellen eingesetzt. Dies sind vor allem Neuronen und Muskelzellen, die einen Ionenstrom durch ihre Membran erzeugen, wenn sie angeregt werden, der wiederum eine Änderung des Membranpotenzials bzw. der Spannung innerhalb und außerhalb der Zelle nach sich zieht. Ein MEA erkennt die extrazelluläre Spannung bzw. das extrazelluläre Feldpotenzial einer Zelle und wandelt diese elektrochemische Spannung in elektrische Spannung um und umgekehrt.

Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)

Bei der Impedanzmessung fließt von einer aktiven Messelektrode ein Wechselstrom sowohl durch die Zelle als auch daran vorbei zu einer Gegenelektrode, die größer ist als die Messelektrode, wodurch ein räumlich ungleichförmiges elektrisches Feld entsteht. Mittels Impedanz können frequenzabhängige Änderungen in den passiv elektrischen Eigenschaften von Zellen gemessen werden. Der gemessene Widerstand wird durch mehrere Faktoren beeinflusst, wie z. B. den elektrischen Widerstand und die Kapazität der Zellmembranen, den Kontakt zwischen Zellen und Elektrode sowie den Widerstand des extrazellulären Mediums und des Cytoplasmas. Am häufigsten eingesetzt wird die Impedanzmessung als sogenanntes Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS). Ein ECIS-Experiment startet mit der Beimpfung von kleinen Goldelektroden mit den zu untersuchenden Zellen und dient dazu, morphologische Zellveränderungen nachzuweisen. ECIS kann das Verhalten von Zellen in jeder Phase der Kultur von der Anhaftung über die Ausbreitung, das Wachstum und die Zellteilung bis hin zum Zelltod registrieren. Diese vielseitige Technik wird bereits erfolgreich zur Untersuchung von Zelladhäsion, Zellbewegung und für Wundheilungsversuche (Migration) eingesetzt. War anfangs noch eine Zelladhäsion auf der Chipoberfläche notwendig, können inzwischen auch dreidimensionale Zellstrukturen untersucht werden, indem die Zellen durch Mikrovertiefungen oder Ansaugkanäle fixiert werden.

Isothermale PCR

Da die klassische PCR auf Temperaturzyklen (Abb. 12) angewiesen und somit zeitaufwendig ist (ca. eine Stunde), wird sie in LoC-Systemen immer öfter durch eine isothermale Amplifikation ersetzt. Mit isothermalen Amplifikations-Methoden funktioniert die Vervielfältigung von Nukleinsäuren bei einer konstanten Temperatur (meist 40 °C) und ohne die typischen Temperaturzyklen der PCR. Isothermale Amplifikations-Methoden basieren meist auf DNA-Polymerasen mit Strang-Verschiebungs-Aktivität (Strand Displacement Activity), die keine hitzedenaturierte DNA (Einzelstränge) brauchen, um den komplementären Strang zu synthetisieren. Vielfältige Methoden wurden entwickelt, für LoC-Systemen eignet sich hiervon idealerweise die Recombinase Polymerase Amplification (RPA), die z. B. während des letzten Ebola-Ausbruchs eingesetzt wurde, um erkrankte Personen durch den Nachweis der Ebola-Viren-DNA zu identifizieren. In dieser Methode wird die DNA durch das Zusammenspiel von Rekombinase, DNA-Polymerase und DNA-bindenden Proteinen vervielfältigt. Zunächst bindet die Rekombinase den PCR-Primer und öffnet das doppelsträngige DNA-Template an der zum Primer komplementären Sequenz. Der geöffnete Doppelstrang wird durch Einzelstrang-DNA bindende Proteine stabilisiert, die Rekombinase löst sich ab, die Polymerase verlängert das 3‘ Ende des Primers und vervielfältigt die Zielsequenz über Wiederholungen des beschriebenen Vorgangs. Im Lab-on-a-Chip legt man die lyophilisierten Enzyme und die Primer vor und muss nur noch die zu untersuchende DNA zugeben. Analysenzeiten von 10 min sind so möglich.
Abb. 12

PCR-Modul

Lab-on-a-Chip PCR Modul für PCR-Zyklen im 3 Schritt-Verfahren (Denaturierung, Primer-Annealing, Elongation). In Längsrichtung sind die 3 Temperaturzonen (95 °C, 55 °C, 72 °C) anlegbar, in Querrichtung werden die PCR-Zyklen durchlaufen. Die Probentröpfchen können sehr schnell hintereinander aufgegeben werden und sind durch ein Mineralöltröpfchen voneinander getrennt, um eine Rückvermischung zu verhindern

Mikro-Kapillar-Elektrophorese

In der Elektrophorese erfolgt die Auftrennung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld einer Trägermatrix. Die Wanderungsgeschwindigkeit einzelner Teilchen hängt von ihrer spezifischen elektrophoretischen Beweglichkeit (Mobilität) ab. Diese wird durch die unterschiedlichen oberflächlichen Ladungen und der Molekülgröße bestimmt. Ein Substanzgemisch wird dabei in einzelne Zonen aufgetrennt. Die Nachteile der klassischen Gelelektrophorese sind ihre Durchführungsdauer von etwa einer Stunde und das sogenannte „Joule Heating“. Dabei erhitzt sich das Gel mit zunehmender Stärke des elektrischen Feldes, welche jedoch für eine schnellere Auftrennung gebraucht würde. Mikrofluidische Kanäle in den Dimensionen 20–50 μm Kanalbreite und 5–40 μm Kanalhöhe bieten durch das große Oberfläche/Volumen Verhältnis den Vorteil einer schnellen Wärmeableitung, so dass eine Spannung von bis zu 30.000 V angelegt werden kann. Außerdem sind sehr geringe Mengen an Probenmaterial für die Detektion mittels Kapillarelektrophorese (CE) ausreichend. Mit LoC-Anwendungen der Kapillarelektrophorese können qualitative und quantitative Analysen von DNA-, RNA- und Protein-Proben mit einer hohen Auftrennungseffizienz sowie kurzen Analysezeiten durchgeführt werden. In einer solchen LoC-CE erzeugen Elektroden die notwendigen Spannungsgradienten, so dass nach der Befüllung der Mikrokanäle mit einem elektrisch leitfähigen Puffer sowohl die Bewegung des Puffers als auch die Bewegung der Analyten in den einzelnen Kanälen gesteuert werden kann. Folglich wird über das Verhältnis und die Abfolge der Spannungsveränderungen die Auftrennung der Proben kontrolliert. (Abb. 13)
Abb. 13

Mikro-Kapillar-Elektrophorese Elektropherogramm einer aufgereinigten RNA aus E.coli. Die Peaks stellen die 16S- und 23S-rRNA dar (Foto: Eberhard Franke, www.eberhardfranke.com)

ELISA

Der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) wird zur Konzentrations-bestimmung von Proteinen eingesetzt und basiert auf dem Messprinzip der Kolorimetrie. Das zu untersuchende Protein adsorbiert zuerst an einen festen Träger, z. B. auf dem Boden einer 96-well Platte. Anschließend hybridisiert ein Detektionsantikörper. Ein am Detektionsantikörper gebundenes Enzym (meist Meerrettich Peroxidase oder Alkalische Phosphatase) setzt einen Farbstoff um, erzeugt so eine Signalverstärkung und erlaubt einen kolorimetrischen Nachweis. In der Proteinanalyse ist die Verwendung einer Chip-basierten ELISA Plattform mit Fluoreszenz-basierter Detektion sehr gut geeignet, um große Kohorten von Proben zu untersuchen und zwar sowohl im reverse-phase als auch im Sandwich Assay. Im reverse-phase Assay werden die Proben auf dem Substrat immobilisiert und die Detektionsantikörper anschließend als Nachweisreagenzien verwendet. In der Sandwichanordnung erfolgt eine Aufkonzentration des Targets am Fängerantikörper mit anschließendem Nachweis über den Detektionsantikörper. Der Aufbau und die Durchführung des LoC-ELISAs ähneln folglich dem klassischen 96-Well Plattenformat, jedoch sind alle notwendigen Reagenzien mit Ausnahme der zu untersuchenden Probe in Reservoirs vorgelegt. Auch die Nachweisgrenzen sind vergleichbar. So haben Sun et al. im ELISA-LoC Staphylococcal Enterotoxin B (SEB) mit einer Nachweisgrenze von 0,1 ng/ml gemessen und waren damit genau so sensitiv wie mit einem konventionellen ELISA (Sun et al. 2010). Schwieriger gestaltet sich die Analyse von Blut. Hier ergibt sich ein Empfindlichkeitsproblem aufgrund des großen dynamischen Bereichs von Proteinen, die im Blut vorhanden sind. Mittel- bis hochgradig abundante Proteine sind leicht zu detektieren, während die in niedrigen Konzentrationen vorkommenden Proteine eine reduzierte Detektierbarkeit aufweisen. Insbesondere die beiden am häufigsten vorkommenden Blutproteine Albumin und IgG stören den Nachweis der niedrig abundanten Proteine. Hier sind erste Erfolge erzielt worden, indem mehrere Firmen Affinitätssäulen anbieten, um einfach und schnell Albumin und IgG, die zusammen mehr als 60 % der Blutproteine ausmachen, abtrennen zu können.

Chip-Zytometrie

Die Chip-Zytometrie basiert auf der Immobilisierung von Zellen auf speziellen Objektträgern (Chips). Während in der parallelen Markeranalyse im Fluoreszenzmikroskop oder im FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) die Anzahl der Marker auf 4 bis maximal 5 begrenzt ist, da durch den sogenannten Crosstalk zweier Farbstoffe ein gewisser Wellenlängenabstand zwischen zwei Fluoreszenzfarbstoffen eingehalten werden muss, können in der Chip-Zytometrie die Zellen hinsichtlich Morphologie, Expression von Oberflächenmarkern und intrazellulärer Funktion durch aufeinander folgende Antikörperfärbungen untersucht werden (Hennig et al. 2009). Hierbei wird jede Antikörperfärbung in einem Bild abgespeichert und anschließend die gleiche Probe mit einem weiteren Antikörper gegen eine andere zelluläre Struktur hybridisiert, usw. So lassen sich bis zu 40 Marker in der gleichen Zellprobe messen und damit Zellen umfassend molekular, immunologisch und funktionell charakterisieren. Die Chip-Zytometrie ermöglicht Analysen auf Einzelzellebene sowie die Lagerung der Chips; je nach Zellpopulation für mehrere Jahre. Damit ist die Chip-Zytometrie anderen Analysemethoden, wie z. B. der Fluoreszenzmikroskopie und der Durchflusszytometrie sowohl durch die größere Anzahl nachweisbarer Marker als auch durch die Lagerbarkeit des Zellmaterials überlegen.

T-Zell Chip

Regulatorische T-Zellen, wie z. B. CD4+ und CD25+, vermitteln die Induktion und Aufrechterhaltung von Immuntoleranz und hemmen die Aktivierung anderer Immunzellen. Sie sind protektiv bei Autoimmunerkrankungen und können eine Immuntoleranz gegen allogene Transplantate erzeugen. Da T-Zellpopulationen sehr heterogen sind, sind Methoden wichtig, mit denen regulatorische T-Zellen sicher von anderen T-Zellen separiert werden können. So können Subpopulationen von T-Zellen anhand ihres Genexpressionsprofils charakterisiert werden. Mit Hilfe eines humanen T-Zell Chips können regulatorische T-Zellen sicher identifiziert und isoliert werden.

Organ-on-a-Chip

Um Zellwachstum und korrekte Gewebefunktion zu unterstützen und damit Konditionen zu erschaffen, die möglichst nah an der in vivo Situation des Menschen sind, ist die Anwendung von dreidimensionalen Assays nötig. Während zu Beginn ethisch umstrittene Organstanzen eingesetzt wurden, werden mittlerweile dreidimensionale Organoide durch die Nutzung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugt, die sich vergleichsweise einfach in verschiedene Gewebetypen differenzieren lassen (Cochrane et al. 2018). Werden sie von Patienten mit definierten Krankheitsbildern, z. B. bestimmten Gendefekten, isoliert, können konkrete Erkrankungssituationen wie etwa Morbus Parkinson präzise simuliert und in verschiedenen Organen abgebildet werden. Auf einem solchen Chip lassen sich mehrere Reservoire und Zellkulturkammern mit den verschiedenen Organoiden über ein gemeinsames mikrofluidisches Kreislaufsystem mit Hilfe einer Mikropumpe durchströmen (Abb. 14)
Abb. 14

Lab-on-a-Chip Modul für die dynamische Zellkultivierung: Durch den Medienfluss über die Kanäle können in-vivo Bedingungen besser simuliert werden, z. B. die Nährstoffaufnahme und die Elimination von Stoffwechselendprodukten, so dass sich die Effizienz des Stoffwechsels erhöht. Über zwei Kreisläufe können Zellen (seeding inlet) und Substanzen (stimulation inlet) getrennt voneinander gehandhabt werden. Außerdem ist die Analyse der Zellen orts- und zeitaufgelöst durch die verschiebbare Sensorik möglich

.
Durch die Kombination mehrerer Gewebekulturen miteinander, z. B. von Darm, Leber, Haut und Niere, kann eine orale Wirkstoffapplikation nachgestellt und untersucht werden. Solche Gewebekulturen existieren bereits für Blutgefäße, Knochen, Knorpel und Fettgewebe, weitere sind in der Entwicklung, etwa für die Plazentaschranke. Sie lassen sich bis zu 28 Tage stabil auf dem Chip kultivieren und zur Substanztestung einsetzen (Maschmeyer et al. 2015). Organ-on-a-Chip Systeme erlauben es, pharmakologische Testreihen schneller und effizienter durchzuführen. Je näher der Organchip den in-vivo Bedingungen ist, desto wertvoller wird er als pharmakologisch verwendbare Alternative zum Tierversuch, zu dem aus Tierschutz- und Kostengründen ethische und wirtschaftliche Alternativen gesucht werden. Insbesondere über die Mikrofluidik von LoC-Systemen ist es möglich, das komplexe Mikromilieu von dreidimensionalen Zell- und Gewebekulturen aufrecht zu erhalten und mittels Sensoren zu regulieren. Über Multiparametermessungen z. B. von Impedanz, pH-Wert und Sauerstoffgehalt, lassen sich Rückschlüsse auf Metabolismus, mitochondriale Aktivität und Redoxpotential ziehen. Hierbei ermöglicht der Organ-Chip eine Standardisierung von in-vitro Zellkulturen, eine Verringerung von Tierversuchen über die systemische, zellbasierte und damit tierversuchsfreie Substanztestung und zukünftig auch eine personalisierte Untersuchung und Diagnostik von Patienten (Abb. 15).
Abb. 15

Schematische Darstellung eines Multi-Organ-Chips. Durch die technische Nachbildung der menschlichen Physiologie können Wirkstoffe getestet und viele Tierversuche ersetzt werden

Integration verschiedener mikrofluidischer Einheiten für zellbiologische Anwendungen

Die Kombination von Mikromischer, Inkubationskammer und Separator kann zur Manipulation oder Analyse von einzelnen Zellen genutzt werden und stellt damit eine Möglichkeit dar, wie mehrere Grundoperationen geschickt auf einem einzigen Chip miteinander kombiniert werden können. Ein Beispiel eines solchen LoC-Systems ist in Abb. 16 gezeigt. Das System besteht aus mehreren funktionalen, mikrofluidischen Modulen, die direkt miteinander verknüpft sind: das erste Modul ist ein Split-and-Recombine Mikromischer, gefolgt von einer Inkubationskammer und einem weiteren Mikromischer; das letzte Modul bildet ein Spiralseparator mit drei Ausgängen. Über die Eingänge der Mikromischer können sowohl Zellsuspension als auch weitere Fluide (z. B. Nährmedium, Detergenzien, Puffer oder Quenchinglösungen) in das System eingeführt, schnell und homogen miteinander gemischt werden und anschließend für eine definierte Zeit in der nachfolgenden Inkubationseinheit verweilen. Integrierte Herringbone-Strukturen in den Inkubationskanälen sorgen hierbei für eine permanente Vermischung und vermeiden, dass die Zellen in den Kanälen sedimentieren. Der finale Spiralseparator ermöglicht einen Transfer der Zellen in frisches Medium (oder Puffer) und eine gleichzeitige Separation der Zellen von ihrem alten Medium. Aufgrund der kleinen Dimensionen des Chips kann eine externe Temperaturkontrolle über Peltier-Elemente ermöglicht werden (Bahnemann et al. 2013).
Abb. 16

Lab-on-a-Chip Design zur Manipulation tierischer Zellen. (a) Split-and-Recombine Mikromixer, (b) Herringbonestruktur der Inkubationskammer, (c) Spiralseparator

Über Eingang 1 und 2 können so beispielsweise eine Zellsuspension und ein Puffer mit Transfektions- DNA (Tarnsfektions-Vektoren) eingebracht werden. In der folgenden Inkubationsstrecke penetrieren die Vektoren in die Zellen. An Eingang 3 kann ein weiteres unterstützendes Agens (z. B. chemisches Transfektions-Detergens) zugegeben werden. Am Ende der zweiten Inkubationsstrecke werden im Spiralseparator die Zellen vom Transfektionspuffer getrennt und beispielsweise in ein Wachstumsmedium, das über Eingang 4 zugespeist wird, transferiert.

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  1. 1.Institute of Technical ChemistryLeibniz University HannoverHannoverDeutschland

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