Comparison of immunofluorescence colony-staining in media, selective isolation on pectate medium, ELISA and immunofluorescence cell staining for detection of Erwinia carotovora subsp. atroseptica and E. chrysanthemi in cattle manure slurry

Abstract

Various isolation and serological techniques were compared for the detection ofErwinia carotovora subsp.atroseptica (Eca) andE. chrysanthemi (Ech) in cattle manure slurry containing c. 10⁸ colony forming units (cfu) per ml. The slurry samples could be preserved at −80°C for 8 months without reduction in the number of bacteria but not at −20°C. Samples stored at −80°C were inoculated with concentrations of the target bacterium ranging from 10² to 10⁸ per ml. Only immunofluorescence colony-staining (IFC) in combination with selective media was able to detect the target organism at a concentration of 100 cells per ml. No IFC-positive colonies were found in pour plates of the non-inoculated cattle slurry. The recovery of the target bacterium from slurry inoculated with 10² cfu of Ech per ml was 64% in PT medium (containing polygalacturonic acid) and 19% in crystal violet pectate medium (CVP). Recoveries of Eca were 32% and 82%, respectively. Ech and Eca could be detected at levels of 10³ cfu per ml of slurry by isolation on CVP. Crude filtration procedures were necessary for analysis of slurry samples with immunosorbent immunofluorescence (ISIF) cell staining. The detection level of ISIF for Ech was 10⁵ cells per ml of slurry. IF-positive cells were incidentally observed in the non-inoculated slurry. Detection of Ech and Eca with ELISA was only possible in slurry inoculated with 10⁸ cells of the target bacterium per ml.

Samenvatting

Verschillende isolatie- en serologische methoden werden vergeleken om de doelbacteriënErwinia carotovora subsp.atroseptica (Eca) enE. chrysanthemi (Ech) aan te tonen in runderdrijfmest met een natuurlijke bacterieflora van ca 10⁸ kolonievormende eenheden(cfu) per ml. De mestmonsters konden gedurende de onderzoekperiode tenminste 8 maanden bij −80°C worden bewaard zonder dat er een afname van het aantal levende mestbacteriën werd geconstateerd, terwijl bij bewaring bij −20°C wel een afname werd gevonden. De ontdooide mestmonsters werden geïnoculeerd met de doelbacterie in concentraties tussen 10² en 10⁸ per ml. De laagste concentratie van de doelbacterie, 10² cfu per ml, kon alleen worden aangetoond met de immunofluorescentie-kleuring van bacteriekolonies (IFC) in een selectief medium. Met deze techniek was het percentage herisolatie vanuit drijfmest geïnoculeerd met 10² Ech cfu per ml respectievelijk 64% in PT-medium (bevat polygalacturonzuur) en 19% in kristalviolet pectine medium (CVP). Voor Eca bedroegen deze percentages respectievelijk 82% en 32%. In de niet-geïnoculeerde mestmonsters werden geen IFC-positieve kolonies gevonden. Via isolatie op CVP konden 10³ of meer cfu van Eca en Ech worden aangetoond. Ruwe filtratie van de mestmonsters was nodig voor het aantonen van Eca- en Ech-cellen met immunoadsorptie immunofluorescentie microscopie. De detectiedrempel lag voor deze techniek op 10⁵ bacteriecellen per ml mestmonster. In niet-geïnoculeerde mest werden incidenteel IF-positieve bacteriën gevonden. Het aantonen van Ech en Eca met ELISA was slechts mogelijk in mest geïnoculeerd met 10⁸ of meer cellen van de doelbacterie per ml.