Cryopreservation of Azotobacteraceae in liquid nitrogen

Summary

Agar-grown cultures of 144 strains of Azotobacteraceae were suspended in 0.5 ml of 10% (v/v) glycerol in glass ampoules and rapidly frozen and stored in liquid nitrogen. On revival, ampoules were rapidly warmed by agitation in a waterbath at 33°C until thawing occurred. All cultures remained viable for up to 7.5 years, grew with short lag phases on revival and suffered no apparent phenotypic changes. Quantitative assessments of representative strains of all species suffered losses in viability after 2.5 or 5 years in liquid nitrogen that were generally less than one decimal reduction from unfrozen suspensions of 10⁷–10⁹ cells/ml. The method is considerably better than freeze-drying or simple desiccation for the more-difficult species likeAzomonas insignis, A. agilis, Azotobacter beijerinckii, Azomonotrichon macrocytogenes andDerxia gummosa, and indications are that strains of all species could be preserved in this way for decades.

Résumé

Les cultures sur agar de 144 souches d'Azotobacteraceae ont été suspendues, chacune, dans 0.5 ml de glycerol à 10% (vol. vol.⁻¹) dans des ampoules en verre, congelées rapidement et conservées dans l'azote liquide. Pour les revivifier, les ampoules ont été très rapidement réchauffées par agitation dans un bain d'eau à 33°C jusqu'au dégel. Toutes les cultures sont restées viables pour des périodes allant jusqu'à 7.5 ans, se sont développées avec des phases de latence courtes lors de la revivification et ne présentaient aucun changement phénotypique. Les souches représentatives de chaque espèce n'ont souffert en général que de pertes de viabilité inférieures à une réduction décimale, par rapport à la culture de départ qui contenait entre 10⁷ et 10⁹ cellules par ml. Cette méthode de conservation est considérablement meilleure que la lyophilisation ou la simple dessication pour les espèces plus délicates commeAzomonas insignis, A. agilis, Azotobacter beijerinckii, Azomonotrichon macrocytogenes etAzomonas gummosa. Des indices suggèrent que les souches de toutes les espèces pourraient bien être consevables pendant des décades.

Resumen

Se suspendieron 144 cepas de azotobacteriaceas, cultivadas en agar, en 0.5 ml de glicerol al 10% (v/v) en viales de cristal que se congelaron rapidamente y se almacenaron en nitrógeno líquido. Para recuperar las cepas se calentaron los viales mediante agitación en un baño de agua a 33°C hasta que se deshelaron los cultivos. Todas las cepas permanecieron viables hasta 7.5 años, al recuperarlas crecieron con fases lag cortas y no sufrieron cambios fenotipicos apreciables. Las cepas representativas de todas las especies sufrieron perdidas de viabilidad inferiores a un decimal comparadas con suspensiones no congeladas de 10⁷–10⁹ células/ml; después de permanecer en nitrógeno líquido 2.5 ó 5 años. Este método es sensiblemente mejor que la liofilizatión o la simple desecación para las especies más dificiles como:Azomonas insignis, A. agilis, Azotobacter beijerinckii, Azomonotrichon macrocytogenes, y,Derxia gummosa. Existen indicios que permiten suponer que cepas de todas estas especies podrían conservarse mediante este método durante décadas.