Zur Technik und Spezifität des histochemischen Carboanhydrasenachweises im Modellversuch und in Gewebsschnitten von Rattennieren

Zusammenfassung

Es wird eine neue haltbarere Inkubationslösung zum histochemischen Carboanhydrasenachweis beschrieben. Die Gefahr unspezifischer, diffuser Niederschläge ist bei nicht zu langen Bebrütungszeiten praktisch ausgeschaltet.

Die die Carboanhydraseaktivität anzeigenden Kobaltkarbonatniederschläge entstehen auf folgende Weise: Wird CO₂ entfernt, kommt es in den folgenden, voneinander abhängigen Reaktionen zu einer Gleichgewichtsverschiebung, die von der Carboanhydrase beschleunigt wird:

$$\begin{gathered} 2 HCO_3^ - - CO_3^ = + H_2 CO_3 \hfill \\ Carboanhydrase \hfill \\ H2CO3 - H_2 O + CO_2 \uparrow \hfill \\ \end{gathered} $$

Bei dieser Verschiebung des Gleichgewichtes fallen vermehrt CO ⁼₃ -Ionen an, die von den gleichzeitig in der Lösung befindlichen Co-Ionen ausgefällt werden. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, die Gewebsschnitte auf der Oberfläche der Inkubationslösung schwimmen zu lassen.

Die obengenannte durch die Carboanhydrase beschleunigte Gleichgewichts-verschiebung geht auch ohne Fermentwirkung mit einer bemerkenswerten Geschwindigkeit vor sich.

Von verschiedenen für den Carboanhydrasenachweis an Gewebsschnitten untersuchten Fixierungsmitteln haben sich eiskaltes Azeton, Methanol und Äthanol am besten bewährt.

Prinzipielle Übereinstimmung besteht zwischen Modellversuchen mit einem standardisierten Carboanhydrasepräpart „Cartase“ und den Versuchen mit Gewebsschnitten. Erhitzen der Präparate auf 90° C oder Behandlung mit einem sublimathaltigem Fixierungsmittel vor der Inkubation hemmen die Reaktion. Weiterhin war eine komplette Hemmung der Enzymaktivität nach Zusatz von Acetazolamid zur Inkubationslösung nachweisbar. Diese Resultate lassen die Spezifität des histochemischen Carboanhydrasenachweises als gesichert erscheinen.

Die Histotopographie der Carboanhydrase in der Rattenniere wird dargelegt.

Summary

The composition of a more stable incubation solution for histochemical demonstration of carbonic anhydrase and its modification is described. The danger of producing nonspecific, diffuse precipitates is practically eliminated, if the incubation period is not too long. The precipitate of cobalt carbonate, indicating carbonic anhydrase activity is brought about in the following way. If CO₂ is able to escape, carbonic anhydrase will accelerate the attainment of equilibrium in the following reactions:

$$\begin{gathered} 2 HCO_3^ - - CO_3^ = + H_2 CO_3 \hfill \\ carbonic anhydrase \hfill \\ H_2 CO_3 - H_2 O + CO_2 \uparrow \hfill \\ \end{gathered} $$

By the displacement of the equilibrium position there are produced a great many CO ⁼₃ ions which are precipitated by Co^.. ions in the incubation mixture. For this reason it is necessary to float the tissue sections on the surface of the incubation medium.

The equilibrium position of the reactions described above is displaced spontaneously with remarkable speed.

Of the various fixatives tested, ice-cold acetone, methanol and ethanol proved to be most satisfactory for the demonstration of carbonic anhydrase activity in tissue sections.

There is a general agreement between experiments using a commercial preparation of carbonic anhydrase («Cartase») and experiments using tissue sections. Tissue heated to 90° C or pretreated with fixatives containing sublimate will give negative results. A complete inhibition of enzymatic activity will also occur, if acetazolamid is added to the incubation mixture. These results argue in favor of the specifity of this histochemical demonstration of carbonic anhydrase activity.

The distribution of carbonic anhydrase in rat kidney is described.