Die Isolierung und quantitative Bestimmung der Carotinoide und Chlorophylle von Blättern, Algen und isolierten Chloroplasten mit Hilfe dünnschichtchromatographischer Methoden

Summary

Methods for a rapid quantitative determination of chlorophylls and carotenoids are decribed.

The extraction of pigments was carried out with different kinds of plant material, such as algae, leaves and chloroplasts. The separation of the carotenoids from these extracts was succeeded by an adsorptionchromatographic process in which the thin-layer consists of anorganic adsorbents (CaCO₃, MgO, Ca(OH)₂). The basicity of the layer is further increased by the addition of KOH; thereby the chlorophylls are retained at the starting line and the overlapping of chlorophylls and xanthophylls on the chromatogram can be avoided.

With this method even those carotenoids can be separated which differ only in the position of a double bond, as for instance α- and β-carotene, and lutein and zeaxanthin. Thus the separation of all the principal carotenoids on a single chromatogram is possible, for example from a Chlorella extract (in order of decreasing R_f-value): α-carotene, β-carotene, lutein-5,6-epoxide (traces), violaxathin, lutein, antheraxanthin, neoxanthin neo A, neoxanthin and zeaxanthin. Furthermore the chromatographic behaviour of the carotenoids ζ-carotene, γ-carotene, lycopene and rhodoxanthin, which are found only rarely, is described.

The chlorophylls a and b are separated by a partition chromatographic process on the second thin-layer; this layer consists of silica gel mixed with ascorbic acid as an antioxidant. An apparatus for an equal spreading of defined quantities of the extract on the starting line and new methods for a rapid quantitative elution of the pigments from the adsorbent are described.

The specific extinction coefficients E ^{1 %}_{1 cm} for antheraxanthin in ethanol and for α-carotene in chloroform, which were needed for the calculation of the pigment quantity were determined.

Zusammenfassung

Es werden dünnschichtchromatographische Methoden zur schnellen quantitativen Bestimmung der Chlorophylle und Carotinoide angegeben. Als Beispiel für verschiedenes pflanzliches Ausgangsmaterial wird die Extraktion der Farbstoffe aus Algen, Blättern oder Chloroplasten genauer beschrieben.

Aus diesen Extrakten erfolgt die Auftrennung der Carotinoide nach einem adsorptionschromatographischen Verfahren; die Dünnschicht ist hierbei aus anorganischen Adsorbentien (CaCO₃, MgO, Ca(OH)₂) zusammengesetzt. Die Basizität der Schicht wird durch Zugabe von KOH weiter verstärkt; dadurch gelingt es, die Chlorophylle am Auftragungsort zurückzuhalten, so daß die sonst auftretenden störenden Überlagerungen von Chlorophyllen und Xanthophyllen im Chromatogramm einwandfrei vermieden werden können. Mit dieser Methode lassen sich auch, solche Carotinoide separieren, welche sich nur in der Lage einer Doppelbindung unterscheiden, wie z. B. α- und β-Carotin oder Lutein und Zeaxanthin. In einem einzigen Chromatogramm ist deshalb die Trennung aller wesentlichen Carotinoide möglich, aus einem Chlorella-Extrakt z. B. (mit fallendem R_f-Wert): α-Carotin, Lutein-5,6-Epoxyd (Spuren), Violaxanthin, Lutein, Antheraxanthin, Neoxanthin Neo A, Neoxanthin und Zeaxanthin. Ferner wird das chromatographische Verhalten der nicht allgemein vorkommenden Carotinoide ζ-Carotin, γ-Carotin, Lycopin und Rhodoxanthin beschrieben.

Die Chlorophylle a und b werden aus dem Gesamtextrakt auf einer zweiten Dünnschicht nach einem verteilungschromatographischen Verfahren getrennt; diese Schicht besteht aus Kieselgel, dem Ascorbinsäure als Oxidationsschutz beigemischt wird. Eine Apparatur zur gleichmäßigen, strichförmigen Auftragung definierter Extraktmengen und Vorrichtungen zur schnellen quantitativen Eluierung der Farbstoffe aus dem Adsorbens werden beschrieben.

Die für die Berechnung der Farbstoffmengen noch fehlenden spezifischen Extinktionskoeffizienten E ^{1 %}_{1 cm} für Antheraxanthin in Äthanol und α-Carotin in Chloroform wurden ermittelt.