Zusammenfassung
Das T/A-Cloning basiert auf der Fähigkeit vieler thermostabiler DNA-Polymerasen an jedes 3′-Ende eines synthetisierten PCR-Fragmentes ein einzelnes überhängendes Nucleotid anzufügen (3′-Adenylierungsaktivität) (Abb. 6.1) (Clarke et al. 1988). Präferentiell wird ein Adenosin-Nucleotid eingefügt, aber es können auch bei geringer dATP-Konzentration alle weiteren Nucleotide herangezogen werden.
Alle PCR-Fragmente mit einem A-Überhang lassen sich in einen linearisierten T-Überhang Vektor relativ leicht und ohne vorherige enzymatische Behandlung (z. B. Restriktionsverdau) ligieren (Abb. 6.2), weshalb das T/A-Cloning eine schnellere und einfachere Methode gegenüber dem Restriktionsverdau sowie Blunt-end-Ligationen darstellt (Zhou et al. 1995). Zudem müssen keine speziell modifizierten Oligonucleotide konstruiert werden. Allerdings ist eine richtungsorientierte Klonierung nicht möglich, und es ist essentiell, dass die PCR-Fragmente unmittelbar nach der PCR für das T/A-Cloning eingesetzt werden, da eine Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen für mehrere Stunden eine Degradation des A-Überhanges verursacht. Dieses hat die Auswirkung, dass die Ligationseffizienz dramatisch reduziert wird.
Kommerziell können verschiedene T/A-Cloning Kits von z. B. Life Technologies, New England Biolab und Promega erworben werden. Generell kann aber fast jede thermostabile DNA-Polymerase mit den üblichen PCR-Parametern eingesetzt werden (Tab. 6.1).
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Literatur
Forrest R et al (2000) 3′ Overhangs Influence PCR-SSCP Patterns. Biotechniques 29:958–962
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Zhou MY et al (1995) Universal cloning method by TA strategy. Biotechniques 19:34–35
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Müller, HJ., Prange, D.R. (2016). T/A-Cloning. In: PCR - Polymerase-Kettenreaktion. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-662-48236-0_6
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