Determination of Bioactive Peptides in Milk

Summary

Milk contains several bioactive proteins and peptides as original minor constituents. Peptides that are inactive within the sequence of major milk proteins (caseins, whey proteins) are of particular interest. Such peptides are e.g. casomorphins, caseinophosphopeptides and casokinins. These peptides may be released from the appropriate protein precursor during intestinal proteolysis or the manufacture of milk products.

Regarding the significance of bioactive peptides from milk as exogenous regulatory substances, different analytical techniques have been developed for the determination of peptide fragments that are liberated as a result of technological treatment or during intestinal proteolysis. In order to detect bioactive sequences that are hidden within milk proteins an enzymatic in vitro-proteolysis (e.g. with trypsin) has to be performed. The analysis of minor peptide concentrations demands an enrichment of the analyte as well as the application of methods with a low detection limit. For example, the solid phase extraction using C18 cartridges is suitable for the concentration of hydrophobic casomorphins; anion exchange chromatography is useful to isolate phosphopeptides. Reversed phase high-performance liquid chromatography (HPLC) has proved itself to be a versatile procedure for the determination of peptides.

Immunochemical analyses using enzyme-immunoassay (ELISA) provide an advantage regarding specifity and sample throughput as compared with liquid chromatographic methods. Anti-peptide-(lgY)antibodies can be easily prepared from the egg yolks of immunized laying hens and used in ELISA for the determination of peptides. Suitable standard substances and immunogens, respectively, are obtained by solid phase peptide synthesis (Fmoc strategy).

Further studies are needed to examine which bioactive peptides are ingested in physiologically significant amounts from milk and milk products. Nevertheless, the relatively new area of investigation in bioactive peptides have introduced a new criterion for defining the protein and food quality.

Zusammenfassung

Milch enthält verschiedene bioaktive Proteine und Peptide als originäre minore Inhaltsstoffe. Von besonderem Interesse sind biologisch aktive Peptide, die in in-aktiver Form in der Primärstruktur der majoren Milchproteine (Caseine, Molken-proteine) vorliegen. Hierzu gehören zum Beispiel Casomorphine, Caseinophosphopeptide, Casokinine. Diese Peptide können durch enzymatische Proteolyse während der intestinalen Proteolyse oder der Herstellung eines Milchproduktes aus der entsprechenden Proteinvorstufe freigesetzt werden.

Aufgrund der Bedeutung der bioaktiven Peptide aus Milch als exogene regu-lativ wirkende Substanzen wurden verschiedene Analysenverfahren erarbeitet, die einen Nachweis der durch technologische Verarbeitung freigesetzten oder durch intestinale Proteolyse freisetzbaren Peptidfragmente ermöglichen.

Zum Nachweis der in Milchproteinen enthaltenen bioaktiven Sequenzen muß zunächst eine enzymatische in vitro-Proteolyse (z. B. mit Trypsin) durchgeführt werden. Damit geringe Peptidkonzentrationen erfaßt werden können, ist eine Anreicherung des Analyten und die Anwendung von Bestimmungsmethoden mit niedriger Nachweisgrenze erforderlich. Zur Anreicherung ist beispielsweise die Festphasenextraktion mit unpolaren Sorbentien zur Konzentrierung der hydrophoben Casomorphine und die Anionenaustauschchromatographie zur Isolierung von Phosphopeptiden geeignet. Als Bestimmungsmethode für Peptide hat sich die Umkehrphasen (C18) - Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) bewährt.

Im Vergleich zur liquidchromatographischen Bestimmung weisen immunchemische Analysen mittels Enzym-Immunoassay (ELISA) verschiedene Vorteile hinsichtlich Spezifität und Probendurchsatz auf. Anti-Peptid- (IgY) Antikörper lassen sich auf einfache Weise aus Eidottern immunisierter Legehennen isolieren und zur Peptidbestimmung mittels ELISA einsetzen. Geeignete Standardsubstanzen bzw. Immunogene werden mit Hilfe der Festphasen-Peptidsynthese (Fmoc-Strategie) gewonnen.

In künftigen Forschungsarbeiten muß geprüft werden, welche bioaktiven Peptide in physiologisch bedeutenden Mengen aus Milch und Milchprodukten aufgenommen werden. Auf jeden Fall bieten die bisherigen Studien über bioaktive Peptide als wertgebende Inhaltsstoffe neue Aspekte zur Beurteilung der Protein-bzw. Lebensmittelqualität.

Résumé

Le lait contient différentes proteines et peptides bioactives comme ingrédients mineurs d’origine. D’intérêt particulier sont les peptides d’activité biologique, qui sont présentes sous forme inactivée dans la structure primaire des proteines majeures du lait (caseines, proteines du petit-lait). Parmi eux comptent par exemple les casomorphines, les phosphopeptides de caseine et les casokinines. Ces proteines peuvent être liberées par proteolyse enzymatique pendant la proteolyse intestinale ou pendant la fabrication d’un produit laitier.

En raison de l’importance des peptides bioactives du lait comme substance régulative exogène différentes procédures analytiques ont été développées qui permettent une détection des fragments de peptides liberées par processus téchnologique ou par proteolyse intestinale.

Pour détecter des séquences bioactives dans les proteines du lait il faut d’abord faire une proteolyse enzymatique in vitro (par exemple avec trypsin). Pour pouvoir détecter des faibles concentrations de peptides, il faut enrichir l’analyte et appliquer les méthodes de mésure pour basses limites de détection. L’extraction des phases solides avec des sorbants sans pôle sert à concentrer les casomorphines hydrophobes et la chromatographie d’échangé d’anions sert à isoler les phosphopeptides. La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) des phases retournées (Cl8) a fait ses preuves en tant que méthode de détermination de peptides.

En comparaison à la détermination par chromatographie liquide les analyses immunoenzymatiques (ELISA) ont différents avantages concernant la spécificité et la rapidité d’examen des échantillons. Des anticorps (IgY) -anti-peptides se laissent facilement isoler des jaunes d’oeufs des poules pondeuses immunisées et se laissent utiliser à la détermination des peptides par ELISA. Des substances standard adaptées ou des immunogènes sont aquis à l’aide d’une synthèse des peptides à phase solide (stratégie Fmoc).

Des recherches futures doivent examiner quelles peptides bioactives à quantité physiologiquement importante sont ramassées du lait et des produits laitiers. En tout cas, les études actuelles sur des peptides bioactives comme ingrédient de valeur offrent des aspects nouveaux au jugement de la qualité des proteines respectivement de la qualité des produits alimentaires.

Resumen

La leche contiene en minoría diferentes proteinas y péptidos biológicamente activos. Son de gran interés los péptidos biologica mente activos que se encuentran en una forma inactiva en la estructura primaria de la mayor proteina de la leche, la caseina Dentro de ellos tenemos la casomorfina, caseinfosfopéptido y casoquinin. Estos péptidos pueden ser liberados a través de una proteolisis enzimática durante la proteolisis intestinal ó durante la preparación de productos lácteos.

Debido a la importancia que tienen estos péptidos bioactivos de la leche como substancias exógenas reguladoras, se han desarrollado diferentes análisis que permiten la liberación de fragmentos péptidos a través de procedimientos tecnológicos ó a través de una proteolisis intestinal.

Para la comprobación de las secuencias bioactivas que contiene la proteina de la leche, se tiene que realizar primero una proteolisis enzimática in vitro como por Ej. empleando tripsina. Para que sean captadas pequeñas concentraciones de péptidos es necesario un enriquecimiento de lo analizado y la aplicación de técnicas que permiten determinar cantidades mínimas- Para el enriquecimiento de la muestra es necesario la extracción de la fase sólida usando por Ej. sorbentes no polares para concentrar la casomorfina hidrófila, y la cromatografía de intercamnbio de aniones para el aislamiento de fosfopéptidos han demostrado ser efectivos.

Como métodos de determinación de péptidos son eficientes la fase invertida C 18 y la cromatografía HPLC.

En comparación con la determinación usando cromatografía líquida, los análisis inmunoquímicos demuestran mas ventajas con respecto a la especificidad.

Anticuerpos antipéptidos (IG Y) puede ser determinados fácilmente de yema de huevo proveniente de gallinas inmunizadas, y la presencia de péptidos usando el test de ELISA.

Substancias estandarizadas ó inmunogénicas pueden ser ganadas con la ayuda de la síntesis de la fase sólida de péptidos (Fmoc-Strategie).

En trabajos de investigación futura deberá ser probado que péptidos bioactivos pueden ser fisiológicamente ingeridos de la leche.

En todo caso los estudios actuales sobre péptidos bioactivos representan un nuevo aspecto para calificar la proteina del alimento