Zusammenfassung
In diesem Abschnitt sollen einige Methoden vorgestellt werden, die man in diesem Gewerbe fast täglich braucht, der Kern der Molekularbiologie sozusagen. Es ist deswegen etwas ausführlicher gehalten und die Protokolle sind etwas detaillierter, damit man’s im Ernstfall auch nachkochen kann. Hier zeigt sich, was man tatsächlich drauf hat, denn es sind nicht die großen Konzepte, an denen es in der Praxis scheitert, sondern die kleinen Dinge des Alltags. An genialen Techniken mangelt es nicht in der Literatur, doch was tun, wenn die DNA nicht ausfällt, wie sie soll? Da siegt, wer mehr als nur eine Methode auf Lager hat.
Um eine Struktur in das Kapitel zu bringen, orientiert sich die Abfolge der nächsten Abschnitte an der Reihenfolge, die man auch im Labor zumeist einhalten wird, indem man die DNA erst isoliert, dann reinigt, wenn nötig konzentriert und dann die Konzentration der DNA-Lösung bestimmt. Doch zunächst ein Überblick über die in Frage kommenden Nucleinsäuren.
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Notes
- 1.
Zumindest bei Säugetieren; für den Rest der Lebewesen gelten umfangreiche Ausnahmeregelungen.
- 2.
„Encyclopedia of DNA Elements“.
- 3.
Hier übrigens eine hübsche Anekdote zur Bedeutung der Bezeichnung LB Medium: Bertani, der 1951 das Medium erstmals beschrieben hat, bezeichnet es in diesem Artikel hartnäckig einfach nur als LB medium. Das war den Leuten, die es tagtäglich verwendeten, offenbar zu unpersönlich, weshalb bald eine Reihe von „Erklärungen“ die Runde machte, wonach das Acronym für Luria broth, Lennox broth oder Luria-Bertani medium stehen sollte. Bertani selbst hat 50 (!) Jahre später in einer Publikation von 2004 das Geheimnis gelüftet. Im Postscriptum verrät er, dass LB schlicht für lysogeny broth stand – er brauchte es nämlich für die Kultur von lysogenen Phagen.
- 4.
Ich persönlich halte es sogar für vermessen, LB als reiches Medium zu bezeichnen. Aber ich bin wahrscheinlich voreingenommen.
- 5.
STET: 8 % (w/v) Sucrose/5 % (w/v) Triton X-100/50 mM EDTA/50 mM Tris HCl pH 8,0; mit Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
- 6.
TELT: 50 mM Tris HCl pH 8,0/62,5 mM Na-EDTA/2,5 M LiCl/4 % (w/v) Triton X-100; Lagerung bei -20 °C.
- 7.
Entgegen der gängigen Lehrmeinung tut es aber auch eine einzige Bakterienkolonie, die Herstellung einer Übernachtkultur kann man sich also sparen. Seltsamerweise ist es mir in den letzten Jahren immer häufiger passiert, dass die Plasmid-DNA-Ausbeute bei Kulturen, die mit Übernachtkulturen angeimpft wurden, so viel geringer war als bei Kulturen, die mit einer Kolonie angeimpft wurden, dass ich persönlich mittlerweile letzteres Vorgehen als Standard empfehle.
- 8.
SET-Lösung: 25 % (w/v) Sucrose/50 mM Tris HCl pH 8,0/100 mM EDTA; bei 4 °C lagern.
- 9.
Lyse-Lösung: 3 % (v/v) Triton X-100/200 mM EDTA pH 8,0/150 mM Tris HCl pH 8,0; bei 4 °C lagern.
- 10.
Hierbei unbedingt den zu den verwendeten Phagen passenden Bakterienstamm verwenden, sonst findet keine Vermehrung der Phagen statt.
- 11.
Denaturierungslösung: 10 mM Tris HCl pH 8,0/2,5 % (w/v) SDS/0,25 M EDTA pH 8,0.
- 12.
TES-Puffer: 0,1 M Tris HCl pH 8,0/0,1 M EDTA/0,3 % SDS.
- 13.
Lyse-Puffer: 4 M Guanidinium-Thiocyanat/0,5 % Natrium-N-Laurylsarcosin/25 mM Natrium-Citrat pH 7,0/ 0,1 M β-Mercaptoethanol.
- 14.
Um eine Endkonzentration von 0,2 N NaOH zu erhalten.
- 15.
Proteinase K-Puffer: 100 mM NaCl/10 mM Tris HCl pH 8,0/50 mM EDTA pH 8,0/0,5 % SDS/ 20 µg/ml RNase A/0,1 mg/ml Proteinase K.
- 16.
Dieser Schritt ist sehr wichtig. Eventuell bei den ersten Versuchen je ein Aliquot vor und nach RNase-Verdau auf ein Gel auftragen und kontrollieren, dass die RNA weitgehend verdaut ist. Unverdaute RNA bindet später an die Silikat-Membran und wird mit der DNA zusammen aufgereinigt.
- 17.
Oft enthalten die Kits eine Extra-Lösung mit chaotropem Salz für zusätzliche Reinigungsschritte – man erkennt sie allerdings gelegentlich nur am Gefahrenhinweis auf der Flasche, weil die Hersteller die Zusammensetzung ihrer Lösungen nicht preisgeben. Wenn vorhanden, diese verwenden.
- 18.
Die Ausbeute lässt sich deutlich steigern, wenn man die Bakterien nicht in LB, sondern reichhaltigeren Medien wie z. B. TB züchtet (Abschn. 2.2.1).
- 19.
Plasmid-DNA wurde mit NaCl (0,8 M Endkonz.) und PEG-8000 (6,5 % Endkonz.) gefällt.
- 20.
10 % MgCl2 (Endkonz.) und 6,7–10 % PEG-8000 (Endkonz.), Zentrifugation für 10 min bei Raumtemperatur.
- 21.
Wir haben es zum Spaß ausprobiert und diverse Plasmid-DNA-Präps, die wir durch EtOH- bzw. Isoprop-Fällung aus einem Alkalischen Lysat gewonnen haben, einem Härtetest unterzogen. Mit erstaunlichem Ergebnis: Weder nach Inkubation für 1 h bei 37 °C noch nach Übernacht-Inkubation bei Raumtemperatur ließ sich irgendein Abbau der Plasmid-DNA nachweisen!
- 22.
Eine Alternative zum klassischen UV-Photometer ist ein NanoDrop -Spektrophotometer (Thermo Scientific), das für die Messung nur 1 µl Lösung benötigt und im Bereich zwischen 2 und 3700 ng/µl misst. Das Gerät kann auch für Proteinbestimmungen eingesetzt werden.
- 23.
Seit ca. 2008 existiert eine weitere interessante Alternative, die TrayCell von Hellma. Es handelt sich dabei um eine Faseroptische Ultra-Mikro-Messzelle, die kompatibel ist mit den Photometern, die üblicherweise im Labor herumstehen, aber einen etwas anderen Aufbau besitzt als normale Küvetten. Der Lichtstrahl passiert hier nicht direkt die Kammer mit der Flüssigkeit, sondern wird durch ein System von Spiegeln und Lichtleitern in den Deckel geleitet, in dem die Probe sitzt. Weil die Schichtdicke der Messkammer auf 1 mm bzw. 0,2 mm reduziert wurde, kommt man mit 3–5 µl bzw. 0,7–4 µl Probe je Messung aus, die man (laut Hersteller) im Bedarfsfall auch wiedergewinnen kann. Schönes Detail: Weil nur der Deckel mit Probe beladen wird, bleibt die Küvette während der ganzen Messreihe im Gerät.
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Mülhardt, C. (2013). Einige grundlegende Methoden. In: Der Experimentator Molekularbiologie/Genomics. Der Experimentator. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-34636-1_2
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