Recent advances in the structure and function of Clostridium difficile- toxins

Summary

Toxins A and B from Clostridium difficile mediate the tissue damage, diarrhea and intestinal inflammation which occur during infection with this pathogen. The toxins are encoded by two genes tox A and tox B which lie in close proximity on the bacterial chromosome. Nearly all pathogenic strains produce both toxins, while nontoxigenic strains produce neither. The Mr of toxin A is 308,057 with a pI of 5.3. Neither toxins are glycosylated, and are denatured by heat and at pH above 8.0 or below 5.0. The toxins have considerable amino acid homology and nearly identical spacing of cysteine residues suggesting that their secondary structures are similar. The carboxyl-terminal third of both toxins consists of repeating peptides of 20 to 30 amino acids with extensive homology. These repeats contain the receptor binding domain by which the toxin attaches to the plasma membrane of target cells. The catalytic or (enzymatic) activity of toxins A and B is identical; both toxins are specific monoglucosyltransferases that catalyze glucose transfer from UDP-glucose to threonine in position 37 of rho A. Rho A is a low molecular weight GTP-binding protein of the ras superfamily and is a major regulator of actin filament formation in cells. This enzymatic modification of rho proteins by C. difficile toxins explains the disaggregation of actin filaments in exposed cells.

The intestinal effects of toxins are species specific in that toxin B is approximately 10 times more potent than toxin A in human colon, while in rodent intestine only toxin A produces inflammation or diarrhea. These differences probably relate to receptor differences between rodents and humans. Luminal exposure of human or rodent colon or ileum to toxins causes actin filament disaggregation in enterocytes resulting in increased paracellular permeability. This is followed by an acute inflammatory reaction in the lamina propria that involves activation of mast cells, upregulation of leukocyte adhesion molecules on vascular endothelium, release of the neuropeptide substance P and other cytokines and chemokines. The net result is infiltration of the bowel wall with neutrophils and pseudomembranous colitis with exudative diarrhea.

Résumé

Les toxines A et B de C. difficile sont responsables des lesions tissulaires, de la diarrhée et des inflammations intestinales survenant au cours d’une l’infection par ce germe pathogène. Les toxines sont codées par deux gènes, tox A et tox B, qui sont situés à proximité sur le chromosome bactérien. Pratiquement toutes les souches pathogènes produisent les deux toxines, alors que les souches non toxinogènes n’en produisent aucune. Le poids moléculaire relatif de la toxine A est de 308.057, avec un point isoélectrique égal à 5,3. Aucune toxine n’est glycosylée, et elles sont toutes deux dénaturées par la chaleur ou par des pH supérieurs à 8 ou inférieurs à 5. Les toxines présentent des analogies considérables quant aux acides aminés, et l’espacement pratiquement identique des résidus cystéine suggèrent que leurs structures secondaires sont similaires. Le dernier tiers du côté C terminal des deux toxines est formé de séquences peptidiques répétitives, constituées de 20 à 30 acides aminés qui présentent une grande homologie entre eux. Dans ces séquences répétées, on trouve le site de liaison de la toxine par lequel elle se fixe à la membrane plasmique des cellules cibles. L’activité catalytique ou enzymatique des toxines A et B est identique. Les deux toxines possèdent une activité monoglucosyltransférase spécifique, qui catalyse le transfert du glucose de l’UDP-glucose à la thréonine en position 37 de rho A. Rho A est une protéine de faible poids moléculaire, et dont la fixation est GTP-dépendante. Elle appartient à la grande famille des protéines ras, et joue un rôle de régulateur important dans la formation des filaments d’actine dans les cellules. C’est la modification enzymatique des protéines rho par les toxines de C. difficile qui explique la désagrégation des filaments d’actine dans les cellules exposées.

Les effets intestinaux des toxines sont spécifiques de l’espèce considérée. Chez l’homme, la toxine B est environ 10 fois plus puissante que la toxine A au niveau du côlon, alors que dans l’intestin du rongeur, seule la toxine A produit une inflammation ou une diarrhée. Ces différences reflètent probablement celles qui existent au niveau des récepteurs entre les rongeurs et les humains. Chez l’homme ou le rongeur, l’exposition intraluminale du côlon ou de l’iléon aux toxines entraîne une désagrégation des filaments d’actine dans les entérocytes, ce qui provoque une augmentation de la perméabilité paracellulaire. Cela est suivi d’une réaction inflammatoire aiguë de la lamina propria, qui provoque l’activation des mastocytes, une surexpression des molécules d’adhésion des leucocytes sur l’endothélium vasculaire, la libération de substance P, d’autres cytokines et de chemokines. Le résultat final est l’infiltration de la paroi intestinale par des neutrophiles, et la présence d’une colite pseudomembraneuse avec diarrhée exsudative.

Zusammenfassung

Die C. difficile-Toxine A und B bedingen die bei einer Infektion mit diesem pathogenen Keim auftretenden Gewebeschäden, Diarrhöen und Darmentzündungen. Die Toxine werden durch die beiden Gene tox A und tox B kodiert, die nah beieinander auf dem Chromosom des Bakteriums liegen. Fast alle pathogenen Stämme produzieren beide Toxine, nicht toxinogene Stämme dagegen keines von beiden. Das Mr des Toxins A beträgt 308,057 bei einem pI von 5,3. Beide Toxine sind glykosyliert, sie werden durch Hitze sowie bei einen pH-Wert von über 8,0 oder unter 5,0 denaturiert. Die Toxine weisen eine beträchtliche Aminosäurenhomologie und praktisch identische Abstände zwischen den Cysteinresten auf, was darauf schließen läßt, daß ihre sekundären Strukturen ähnlich sind. Das Carboxylterminale Drittel besteht bei beiden Toxinen aus sich wiederholenden Peptiden aus 20 bis 30 Aminosäuren mit hoher Homologie. Diese Sequenzen enthalten die Rezeptorbindungsdomäne, mit der das Toxin an die Plasmamembran der Zielzelle bindet. Die katalytische (oder enzymatische) Aktivität der Toxine A und B ist identisch; beide Toxine sind spezifische Monoglucosyltransferasen, die den Transfer von UDP-Glukose zum Threonin an Position 37 von rho A katalysieren. Rho A ist ein niedermolekulares GPT-bindendes Eiweiß der ras-Superfamilie und ein wichtiger Regulator der intrazellulären Bildung von Aktinfilamenten. Diese enzymatische Modifikation von rho-Proteinen durch C. difficile-Toxine erklärt den Zerfall von Aktinfilamenten in den betroffenen Zellen.

Die intestinalen Wirkungen der Toxine sind artspezifisch insofern, als Toxin B im menschlichen Dickdarm etwa 10mal wirksamer ist als Toxin A, während bei Nagern nur Toxin A Darmentzündungen oder Diarrhöen auslöst. Diese Unterschiede beruhen vermutlich auf den bei Menschen und Nagern unterschiedlichen Rezeptoren. Bringt man die Toxine ins Lumen von Dick-oder Dünndarm von Menschen bzw. Nagern ein, kommt es zu einem Zerfall der Aktinfilamente in den Darmzellen und infolgedessen zu einer erhöhten parazellulären Permeabilität. Die Folge ist eine akute entzündliche Reaktion der Lamina propria mit Mastzellenaktivierung, Vermehrung der leukozytären Adhäsionsmoleküle am vaskulären Endothel, Freisetzung das Neuropeptids Substanz P sowie weiterer Zytokine und Chemokine. Das Ergebnis ist letzten Endes die Invasion von Neutrophilen in die Darmwand und eine pseudomembranöse Kolitis mit exsudativer Diarrhö.