Von Willebrand-Faktor-Multimeranalyse mittels vertikaler Agarose-Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Methode zur schnellen Analyse einer größeren Probenanzahl

Zusammenfassung

Der von Willebrand-Faktor (vWF), ein Adhäsivprotein, wird von Endothelzellen und Megakaryozyten synthetisiert [1]. Das hochmolekulare Glykoprotein vermittelt die Adhäsion von Plättchen an freigelegtes Subendothel, indem es gleichermaßen an Rezeptoren der Plättchenoberfläche und der Extrazellulärmatrix binden kann [2]. Im Plasma zirkuliert der vWF in einer Reihe von Multimeren mit einem Molekulargewicht zwischen 0,44 x 10⁶ und 20 x 10⁶ [3]. Diese Multimere werden auf zellulärer Ebene in einem aus mehreren Schritten bestehenden enzymatischen Prozeß gebildet, der mit der Exprimierung eines Prae-Pro-vWF-Moleküls beginnt. Diese Vorläufermoleküle können am C-terminalen Ende miteinander reagieren, so daß ein etwa 0,56 x 10⁶ großer Pro-vWF entsteht. Nach Glykosylierung und Abspaltung eines 0,80 x 16⁶ großen Proteinfragmentes am jeweiligen N-terminalen Ende kann eine unterschiedliche Zahl dieser Pro-vWF-Moleküle über Disulfidbrücken miteinander verknüpft werden [4]. Diese Multimerisation, mit der Vervielfachung der zur Verfügung stehenden Rezeptoren, ist für die biologische Funktion des vWF entscheidend. Nur die höchstmolekularen Formen ermöglichen eine stabile Plättchenformation an verletzten Gefäßwandabschnitten [5]. Die pathogenetische Vielfalt des von Willebrand-Syndroms (vWS) wird dadurch erklärt, daß nicht nur eine verminderte Bildung des vWF, sondern auch eine Störung dieser komplizierten Multimerbildung vorliegen kann [5]. Nur die Analyse der Quartärstruktur des vWF mittels der Multimeranalyse ermöglicht die Unterscheidung zwischen einem rein quantitativen und einem qualitativen Defekt und ist damit neben der Bestimmung der Plasmakonzentration und des Ristocetin Cofaktors die wichtigste Methode zur Diagnostik und Klassifikation des vWS. Die von RUGGERI und ZIMMERMAN 1981 erstmals beschriebene Analysentechnik, in der die Multimere in einer horizontalen Elektrophorese in einem diskontinuierlichen Puffersystem aufgetrennt und anschließend mit radioaktiv markierten Antikörpern detektiert werden, ist inzwischen mehrfach modifiziert worden [3]. Der elektrophoretische Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosefolie mittels der Western Blot-Technik und der Ersatz der radioaktiv markierten Antikörper durch enzymgekoppelte Antikörpersysteme führten zu einer Vereinfachung der Technik und zu einer Verminderung des Zeitaufwandes von 5–6 Tage auf 2–3 Tage.