Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) Validierung der zerstörungsfreien Histotomographie gesunden Knochengewebes

Zusammenfassung

Durch Fixierung (Formalin), Entkalkung (Schnitte) oder mechanische Bearbeitung (Schliffe) besteht bei der Hartgewebshistologie das Risiko physikalisch-chemischer oder mechanischer Artefakte. Da Studien zur Ätiopathogenese pathologischer Veränderungen meist auf subklinische Läsionen zielen, besteht die Gefahr, daß Artefakte frühe Veränderungen vortäuschen oder vorhandene überdecken. Es wird der Frage einer artefaktminimierten Histologie nachgegangen. Bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) rastert ein monochromatischer Laserstrahl über die Probenoberfläche und dringt in das Gewebe ein. Die Intensität der remittierten Strahlung wird in einem Detektor gemessen. Durch eine konfokale Blende (pinhole) erreicht nur Laserlicht aus einer extrem dünnen In-Fokus-Ebene den Detektor, so daß schrittweises Bewegen des Objekttischs eine tomographische Serie von Einzelbildern visualisiert. Gesunde kortikale Knochenproben des Unterkiefers (n = 20) wurden durchlichtmikroskopisch und im CLSM untersucht: Dabei wurden identische Probenareale an Dünnschliffen nach HE-Färbung visualisiert. Außerdem wurden eingebettete und frische Gewebeblöcke derselben Knochenproben im CLSM histotomographiert. Als Ergebnisse wurden gefunden: 1. Lichtmikroskopische Mikromorphologie kortikalen Knochens ist im CLSM valide visualisierbar. 2. Viele lichtmikroskopisch erst nach Spezialfärbungen darstellbare Strukturen (z.B. Osteozytenfortsätze) können im CLSM an Probenblöcken ohne Vorbereitung mikroskopiert werden. Hieraus können folgende Schlußfolgerungen gezogen werden: 1. Die zerstörungsfreie Histotomographie des CLSM unter der Probenoberfläche vermeidet mechanische Artefakte völlig. 2. Physikalisch-chemische Artefakte werden kontrollierbar, da auch frische Proben mikroskopiert werden können. 3. Die pseudo-dreidimensionale Darstellung erlaubt eine histologische Gewebeinterpretation, die makroskopischen Schichtbildverfahren (CT, MRT) vergleichbar ist.

Summary

Objectives

Fixation (formalin), decalcification (sections) or mechanical treatment (grinding) all bear the risk of artifacts occurring during hard-tissue histology. Because studies on the etiology of pathological changes mostly focus on subclinical lesions, artifacts can simulate early changes or even be superimposed on existing changes. The objective of this study was to determine how artifacts can be reduced.

Material and methods

In confocal laser scanning microscopy (CLSM) a focused laser beam scans the surface of the specimens and penetrates into the tissue. The intensity of the remitted light is recorded. The confocal effect is due to an extremely small aperture (pinhole), excluding light from out-of-focus planes of the sample. By stepwise movement of the object table, a tomographic series of tomographic images is obtained. Sound cortical bone samples of the lower jaw (n = 20) were studied by light microscopy and by CLSM, visualizing identical areas of a ground sectioned sample after H & E staining. Additionally, embedded and fresh blocks of tissue of the same bone sample were studied histotomographically in the CLSM.

Results

(1) Light microscopic micromorphology of cortical bone can be visualized adequately in the CLSM; (2) many structures that can be visualized by light microscopy only after special staining (e.g., osteozyte processes) can be visualized by the CLSM using sample blocks without pretreatment. Conclusion: (1) Nondestructive subsurface histotomography by CLSM totally excludes mechanical artifacts; (2) physicochemical artifacts can be handled more easily because fresh samples can be studied; (3) pseudo-three-dimensional imaging allows histological interpretation of the tissue that is equivalent to macroscopic tomographic techniques (CT, MRT).