A new method for ultrastructural localization of lipid peroxides in the eye

Summary

Lipid peroxidation is considered a prominent feature of age-related retinal degeneration. It is known that lipid peroxides can oxidize benzidine. This property was used to localize lipid peroxides ultrastructurally in the retina.

Methods: (1) Lipid peroxides were formed by incubation of linoleic acid with lipoxygenase from soybean, separated by thin layer chromatography and incubated with tetramethylbenzidine. (2) Lipid peroxides were formed by incubation of porcine retinae with soybean lipoxygenase in an oxygen-saturated atmosphere. For ultrastructural localization, isolated retinae with and without enzymatically synthesized lipid peroxides were fixed with 2 % glutaraldehyde, incubated with 0.5 mg/ml tetramethylbenzidine and embedded for electron microscopy. (3) Eye cups from Syrian golden hamsters were treated in the same way except for incubation with lipoxygenase. The hamsters were kept under constant illumination (1000 lux) for 12 h to enhance lipid peroxidation.

Results: (1) Tetramethylbenzidine was oxidized by linoleic acid peroxides. (2) In the isolated retinae of pigs lipid peroxides became visible as electron-dense structures in the rod outer segments (ROS) after treatment with lipoxygenase and were lacking in the other parts of the retina. Without treatment with lipoxygenase lipid peroxides were only infrequently seen in ROS. (3) In the eyes of light-exposed hamsters, electron-dense reaction products of lipid peroxides were particularly prominent between the basal infoldings of the RPE and within the apical parts of the ROS.

Conclusion: Light or enzymatically induced lipid peroxides can be localized ultrastructurally due to their ability to react with tetramethylbenzidine and osmium in the absence of H₂O₂ to an electron-dense reaction product. Lipid peroxides seem to be removed from the RPE via Bruch's membrane and blood vessels. Disturbance of this pathway may enhance lipofuscin or drusen formation.

Zusammenfassung

Hintergrund: Lipidperoxide spielen eine Rolle bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration. Lipidperoxide können Benzidin in Abwesenheit von H₂O₂ oxidieren. Diese Eigenschaft der Lipidperoxide wurde ausgenutzt, um sie ultrastrukturell sichtbar zu machen.

Methoden: 1. Lipidperoxide wurden in Linolsäure durch Inkubation mit Lipoxygenase gebildet, extrahiert und im Dünnschichtchromatogramm aufgetrennt und mit Tertramethylbenzidin inkubiert. 2. Lipidperoxide wurden in Retinae vom Schwein durch Inkubation mit Lipoxygenase aus Sojabohnen in sauerstoffgesättigter Atmosphäre gebildet. Isolierte Retinae mit und ohne enzymatisch gebildeten Lipidperoxiden wurden mit 2 % Gutaraldehyd fixiert, mit 0,5 mg/ml Tetramethylbenzidin inkubiert, anschließend osmiert und für die Elektronenmikroskopie eingebettet. 3. Goldhamster wurden 12 Stunden intensivem Licht ausgesetzt (1000 Lux), um die Lipidperoxidation zu verstärken. Die Augenbecher der Goldhamster wurden wie unter 2. behandelt, mit Ausnahme der Inkubation mit Lipoxygenase.

Ergebnisse: 1. Tetramethylbenzidin wurde in den Dünnschichtchromatogrammen durch die Linolsäureperoxide oxidert. 2. In den isolierten Retinae von Schweinen wurden Lipidperoxide als elektronendichte Strukturen in den Stäbchenaußensegmenten (ROS) sichtbar. Diese Lipidperoxide fehlten in anderen Teilen der Retina und waren nur ausnahmsweise in ROS vorhanden, die nicht mit Lipoxygenase behandelt wurden. 3. In den lichtexponierten Augen von Goldhamstern waren Lipidperoxide besonders in den apikalen Bereichen der ROS und zwischen den basalen Ausfaltungen des retinalen Pigmentepithels vorhanden.

Schlußfolgerung: Lipidperoxide können im Auge durch Reaktion mit Tetramethylbenzidin und Osmium in Abwesenheit von H₂O₂ ultrastrukturell sichtbar gemacht werden. Mit dieser neuen Methode wurden Hinweise für einen Abtransport von Lipidperoxiden aus dem Auge über die Bruch'sche Membran und die Blutgefäße erbracht. Eine Störung dieses Transportweges könnte die Akkumulation von Lipofuszin im retinalen Pigmentepithel verstärken.