Die ID-Protein-Familie besteht aus 4 Mitgliedern. ID4 zeichnet sich wie alle ID-Proteine durch ein Helix-Loop-Helix-Motiv aus, mittels welchem es mit anderen basischen Helix-Loop-Helix-Proteinen dimerisieren kann. Unter ihren Bindungspartnern finden sich auch Nicht-bHLH-Proteine. Dazu gehören Transkriptionsfaktoren, wie das Retinoblastomaprotein oder die Gruppe der Pax-Proteine [1, 8]. Die Formation der ID-bHLH-Heterodimere führt zu einer dominant-negativen Kontrolle der Gentranskription und reguliert so die Aktivität von Transkriptionsfaktoren, welche für die Regulierung der Zellproliferation in der Entwicklung und der Differenzierung verschiedenster Zelltypen verantwortlich sind [33]. Es ist daher nicht überraschend, dass ein Zusammenhang zwischen der Deregulierung der ID-Gen-Expression und der humanen Krebsentstehung gezeigt werden konnte. In Karzinomen des Pankreas [15] und des Dickdarms [15, 29] ist die Genexpression von ID1, ID2 und ID3 deutlich aufreguliert; folglich wurde diesen Genen primär ein onkogener Charakter zugeschrieben. ID4 hingegen scheint als Tumorsuppressor zu fungieren, da seine RNA-Expression in Prostatakarzinomen [1], humanen Leukämien [32], kolorektalen Karzinomen [25] und Adenokarzinomen des Magens [4] deutlich niedriger ist als in den entsprechenden Normalgeweben.

Aberrante epigenetische Modifikationen der DNA, z. B. Promotorhypermethylierung, stellen zentrale Mechanismen der Genderegulierung in humanen Tumoren dar [14]. Die Hypermethylierung von CpG-reichen Regionen (CpG-Inseln) innerhalb von Genpromotoren ist eine wichtige Voraussetzung für die Inaktivierung von wichtigen Tumorsuppressorgenen, wie p16 INKa, p15 INK4b, p14 ARF, DAPK und MGMT [9]. Für das humane Mammakarzinom wurde bereits die epigenetische Inaktivierung durch eine Hypermethylierung für BRCA1, 14–3-3σ, TIMP3, ESR1, PGR und CDH1 beschrieben [10]. Die Promotorregion von ID4 enthält ebenfalls CpG-Inseln, welche in Adenokarzinomen des Magens als hypermethyliert gefunden wurden und mit dem Verlust der ID4-Gen-Expression assoziiert sind [4]. Verschiedene Studien postulierten eine mögliche Korrelation zwischen ID4-Promotor-Methylierung und Tumorinitiation bzw. -progression, z. B. in kolorektalen Karzinomen [25], humaner Leukämie [32] und Prostatakarzinom [1]. In normalen epithelialen Brustzellen wurde ID4 als konstitutiv exprimiert gefunden, die Expression geht jedoch bereits in präneoplastischen Läsionen verloren [7]. Eine andere Studie beschrieb ID4 als einen negativen Regulator des zentralen Brustkrebstumorsuppressorgens BRCA1 [2, 24]. Darüber hinaus konnte ein Verlust der ID4-Expression in BRCA1/ER-positiven Brustkrebspatientinnen gezeigt werden, sodass angenommen wird, dass ID4 an der Regulierung der ER- und BRCA1-Expression beteiligt ist [21]. Neben diesen Ergebnissen wird die Rolle von ID4 als putativem Tumorsuppressor kontrovers diskutiert und blieb bis jetzt ungeklärt. Im Widerspruch zum häufigen Verlust der ID4-Expression in humanen Tumorentitäten zeigte eine Studie die Aufregulierung von ID4 in der Brustdrüse der Ratte, verbunden mit einer gesteigerten Proliferation und Invasivität der Tumorzelllinien [22]. Eine andere Studie postulierte ID4 als Tumorsuppressor für die Subgruppe der T1-Mammakarzinome und zeigte, dass die aberrante Hypermethylierung des ID4-Gens mit einem erhöhten Risiko für Lymphknotenmetastasen assoziiert ist [26].

Die hier vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Klärung der Rolle der ID4-Promotor-Methylierung für die humane Brustkrebsentwicklung. Zu diesem Zweck analysierten wir eine klinisch-relevante Kohorte von kryokonservierten Gewebeproben von Brustkrebspatientinnen (n=170). Dabei wurde besonderer Wert auf eine repräsentative Zusammenstellung bezüglich Tumorgröße und histologischem Grading gelegt. Mittels In-vitro-DNA-Demethylierung [3] von humanen, malignen Brustkrebszelllinien wollten wir feststellen, inwiefern die ID4-Promotor-Methylierung die ID4-mRNA-Expression beeinflussen kann. Ein weiteres Ziel war es, eine klare Beziehung zwischen ID4-Promotor-Methylierung, ID4-mRNA-Expression und ID4-Protein-Expression in Mammakarzinomproben nachzuweisen. Eine derartige Korrelation wurde bis jetzt in keiner Studie gezeigt. Abschließend korrelierten wir die ID4-Promotor-Methylierung mit klinisch-pathologischen Parametern sowie der ID4-Expression von Brustkrebspatientinnen.

Material und Methoden

Kryokonservierte Patientenproben

Die Brustgewebeproben für die Methylierungs- und Expressionsanalysen stammen von Patientinnen (n=170) mit primären Mammakarzinomen, die an den Universitätskliniken in Aachen, Jena, Regensburg und Düsseldorf (Deutschland) behandelt wurden. Alle Patientinnen gaben ihre Einverständniserklärung für die Einbehaltung und Analyse von Gewebe für Forschungszwecke. Das Gewebematerial wurde sofort nach der Resektion in flüssigem Stickstoff eingefroren. Der Anteil an Tumorzellen in den Proben wurde mittels HE-Färbung bestimmt, nur solche Proben mit einem Anteil an Tumorzellen >70% wurden für die weitere Analysen verwendet. Für Normalgewebe war ein Epithelanteil >30% erforderlich.

Zelllinien

Die verwendeten humanen Brustzelllinien BT20, MDA-MB231, MCF7 und T47D wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) bezogen und den Herstellerangaben entsprechend kultiviert.

Nukleinsäureextraktionen

DNA-Präparationen aus Zelllinien und humanem Gewebe wurde unter Verwendung des QiAmp®-DNA-Kit (Qiagen, Hilden) und den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gewonnen. RNA-Präparationen wurden entsprechend dem TRIzol®-Verfahren nach Herstellerangaben durchgeführt (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Reverse Transkription

1 µg Gesamt-RNA wurde mit dem Promega-Reverse-Transcription-System (Promega, Madison, WI) nach Herstellerangaben in cDNA umgeschrieben.

Semiquantitative Echtzeit-PCR

Die Echtzeit-PCR wurde mit dem LightCycler®-System (Roche Diagnostics, Mannheim) unter Verwendung Intron überspannender Primer nach Herstellerangaben wie beschrieben durchgeführt und mittels komparativer CT-Methode im Vergleich zur GAPDH-Expression ausgewertet [11, 17, 27].

Bisulfitmodifikation und methylierungsspezifische PCR

Sie wurden wie in der Literatur beschrieben durchgeführt [5, 12, 17, 27].

In-vitro-Demethylierung von DNA

Tumorzelllinien wurden in einer Dichte von 3×104 Zellen/cm2 am Tag 0 in einer 6-Loch-Schale ausgesät. Die In-vitro-Demethylierung wurde mit dem Agens 5-Aza-2’-Deoxycytidin (Sigma-Aldrich, Deisenheim) und dem Histondeazetylaseinhibitor Trichostatin A (Sigma-Aldrich, Deisenheim) wie beschrieben durchgeführt [17].

Immunhistochemie

Für die ID4-Protein-Färbung wurden 3 µm dicke, formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte für 30 min bei 72°C getrocknet, in Xylen entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Anschließend wurden die Schnitte für 35 min in Tris-EDTA-Puffer (pH 9,0) zwecks Antigendemaskierung bei 95°C inkubiert. Es wurde ein polyklonaler ID4-Antikörper (Verdünnung 1:150; Inkubation für 90 min; Kaninchen-anti-Human; Sc291, Santa Cruz, CA) verwendet. Der immunhistochemische Nachweis erfolgte unter Verwendung des ChemMate™ EnVision™ Kit (DAKO, Hamburg). Die Schnitte wurden mit Mayer’s Hematoxylin gegengefärbt und mit Entellan®-Einbettmedium (EMS Diatome, Fort Washington, PA) fixiert. Normal- und Tumorgewebe des Dickdarms dienten als Positivkontrollen für die ID4-Protein-Färbung [25]. Die Färbungsintensität wurde von erfahrenen Pathologen nach dem System von Remmele u. Stegner [20] bewertet.

Statistische Methoden

Die statistische Analyse wurde mit der Software SPSS 14.0 durchgeführt (SPSS Software GmbH, München). Eine statistische Signifikanz wurde ab einem p<0,05 angenommen. Ein zweiseitiger Kruskal-Wallis-Test wurde verwendet, um die Expressionsunterschiede zwischen unmethylierten Tumoren, methylierten Tumoren und Normalgeweben zu analysieren. Assoziationen zwischen klinisch-pathologischen Faktoren und molekularen Parametern wurden mittels Fisher’s-Exakt-Test untersucht. Das rezidivfreie Überleben und das Gesamtüberlebensintervall in Relation zu klinisch-pathologischen und molekularen Parametern wurden mittels univariatem Log-rank-Test nach der Methode von Kaplan-Meier sowie mittels multivariater Cox-Regression berechnet.

Ergebnisse

ID4-Methylierung und ID4-Reexpression durch In-vitro-Demethylierung in humanen Brustzelllinien

Initial wurde eine methylierungsspezifische PCR für die Promotoranalyse des ID4-Gens etabliert. Hierfür wurden MSP-Primer verwendet, welche komplementär zu einer Sequenz innerhalb der zentralen CpG-Insel (−615 bis +139) nahe des TSP des ID4-Promoters sind (Abb. 1 a) und einen Sequenzabschnitt, der etwa 30 bp stromaufwärts des TSP beginnt, amplifizieren. Das PCR-Amplikon des unmethylierten ID4-Promotors war 161 bp groß, das des methylierten ID4-Promotors 157 bp. Die für die Reaktion mit unmethylierter DNA verwendeten Primer sind komplementär zu den Basen −194 bis −166 und −60 bis −33. Entsprechend binden die für die Reaktion mit methylierter DNA eingesetzten Primer die Basen −192 bis −166 und −60 bis −35 (alle Positionen relativ zum TSP).

Um eine direkte Assoziation zwischen der ID4-Promotor-Methylierung und der ID4-Gen-Expression nachzuweisen, wurde eine In-vitro-Demethylierungsanalyse an 4 humanen, malignen Brustkrebszelllinien durchgeführt (MDA-MB231, BT20, MCF7 und T47D). Dazu wurden diese Zelllinien mit dem Demethylierunsagens DAC (72 h) und dem Histondeazetylaseinhibitor TSA (24 h) inkubiert. Die ID4-Expression wurde anschließend mittels semiquantitativer Echtzeit-PCR bestimmt (Abb. 1 b). Alle methylierten Zelllinien wiesen nach der Behandlung eine gesteigerte ID4-Expression auf, T47D 119-fach, MCF7 38-fach und BT20 19-fach. Die unmethylierte Zelllinie MDA-MB231 dagegen zeigte nur eine marginale Alteration in ihrer ID4-mRNA-Expression.

Abb. 1
figure 1

a Illustration der ID4-Gen-Promotor-Region und MSP-Primer-Topologie, Lokalisation von 2 CpG-Inseln innerhalb der ID4-Promotor-Region stromaufwärts des TSP, schwarzer Balken Amplikon, U-Primer Bindung an unmethylierte, M-Primer Bindung an methylierte DNA, b In-vitro-Demethylierungsanalyse des ID4-Promotors bei 4 humanen Brustkrebszelllinien (MDA-MB231, BT20, MCF7, T47D), ID4-Methylierungsstatus und FC der ID4-mRNA-Reexpression, DAC 5-Aza-2’-Deoxycytidin, TSA Trichostatin A, c ID4-Promotor-Methylierungsanalyse primärer, humaner Mammakarzinome mittels MSP-Technologie, BT20, MDA-MB231 Positivkontrollen, NK Negativkontrolle. (Mit Genehmigung aus [17]), U unmethylierte, M methylierte DNA, Erläuterung s. Text

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ID4-Promotor-Methylierung in primären, humanen Mammakarzinomen

Wir konnten bereits demonstrieren, dass die ID4-mRNA-Expression in 78% (39/50) aller humanen, primären Mammakarzinomen signifikant herabreguliert ist [25]. Umetani et al. [26, 25] implizierten in einer Studie, dass die Promotorhypermethylierung ein effektiver Mechanismus der ID4-Inaktivierung im humanen Brustkrebs darstelle, wobei sich ihre Untersuchungen auf die Subgruppe von T1-Mammakarzinomen beschränkten [19]. Ein Ziel dieser Studie war es daher, die exakte Methylierungsfrequenz des ID4-Promoters beim humanen Mammakarzinom anhand eines klinisch relevanten Spektrums von Brustkrebspatientinnen zu bestimmen. Hierzu analysierten wir genomische DNA von 170 Patientinnen mit primären Mammakarzinomen mittels MSP-Technologie. Repräsentative Ergebnisse von 9 Patientinnen sind in Abb. 1 c zusammengefasst. Zur Analyse wurden sowohl Primer, welche für unmethylierte Allele des ID4-Promotors spezifisch sind (U-Banden in Abb. 1 c), als auch Primer, welche für methylierte Allele des ID4-Promotors spezifisch sind (M-Banden in Abb. 1 c), verwendet. Die humanen Brustkrebszelllinien BT20 und MDA-MB231 dienten als Positivkontrollen für methylierte bzw. unmethylierte ID4-Promotor-Sequenzen [19], Wasser als Template für die Negativkontrolle der MSP. Insgesamt konnte eine ID4-Promotor-Methylierung in 68,9% (117/170) der Patientinnen nachgewiesen werden. Dementsprechend zeigten 31,1% (53/170) keine ID4-Promotor-Methylierung.

Zusätzlich wurden 13 Normalgewebe getestet, von denen keine einzige Probe eine ID4-Methylierung zeigte. Somit konnten wir zeigen, dass es sich bei der aberranten Hypermethylierung des ID4-Promotors um einen tumorspezifischen Mechanismus handelt.

Korrelation zwischen ID4-Promotor-Methylierung und ID4-Expression im humanen Mammakarzinom

Unser nächstes Ziel war es, zu analysieren, inwiefern ID4-Promotor-Methylierung zwangsläufig auch zu einer Inaktivierung des ID4-Promtors führt. Zu diesem Zweck wurde für einen Teil der Kohorte (n=46), für die der ID4-Promotor-Methylierungsstatus bestimmt wurde, auch die ID4-mRNA-Expressionsstärke ermittelt (Abb. 2 a). Im direkten Vergleich zu einem Standard aus 12 gepoolten Brustnormalgeweben (N) erwies sich der ID4-mRNA-Verlust in den unmethylierten Tumoren (T) als marginal (FC=N/T=1,3). Im Gegensatz dazu wiesen ID4-methylierte Mammakarzinome einen hochsignifikanten Verlust (p<0,001) der ID4-Expression mit einem FC=12,3 auf. Diese Daten zeigen eindeutig, dass die ID4-Promotor-Methylierung mit der ID4-Gen-Inaktivierung assoziiert ist. Die Analyse der ID4-mRNA-Expression in Mammakarzinomen und entsprechenden Mammanormalgeweben bestätigte einen Verlust der ID4-mRNA in 82% der Tumoren (bei einem FC≥2).

Um nachzuweisen, dass die ID4-Promotor-Methylierung ebenfalls zu einem Verlust des ID4-Proteins führt, wurden parallel der ID4-Methylierungs-Status, die ID4-mRNA-Expression und die ID4-Protein-Expression bei 3 Patientinnen bestimmt, von denen jeweils Tumor- (T) und korrespondierendes Brustnormalgewebe (N) verfügbar waren (Abb. 3). Brustkrebspatientinnen mit einem unmethylierten ID4-Promotor wiesen nur einen marginalen Unterschied (FC=1,1, über den Quotienten der Expression von N und T berechnet) in ihrer ID4-mRNA Expression verglichen mit dem entsprechenden Normalgewebe auf. Dementsprechend zeigte sich auf der Proteinebene ebenfalls kein Unterschied der ID4-Expression zwischen Normal- und Tumorgewebe. Mammakarzinompatientinnen mit einem methylierten ID4-Promotor hingegen wiesen einen starken Verlust der ID4-mRNA auf (16-fach bis 71-fach), verglichen mit den entsprechenden Normalgeweben. Diese methylierten Tumoren zeigten ebenfalls einen fast vollständigen Verlust der ID4-Protein-Expression (Abb. 3 b,c).

Abb. 2
figure 2

a Box-Plot-Darstellung des Verlusts der ID4-Expression in Abhängigkeit vom Methylierungsstatus des ID4-Promotors bei Brustkrebspatientinnen, Y-Achse Faktor der ID4-mRNA-Herabregulierung in Brustkrebspatientinnen (n=46) relativ zum Normalgewebestandard (FC), horizontale Linien Mediane der Gruppen; Kästen 25- bis 75%-Quartile; vertikale Linien Spannweite, Minimum und Maximum, b Kaplan-Meier-Analyse des rezidivfreien Überlebens (RFS) von Brustkrebspatientinnen in Abhängigkeit der ID4-Promotor-Methylierung, Zeitverlauf (Monate) und RFS von 115 Brustkrebspatientinnen mit positiver (untere Kurve) und negativer (obere Kurve) ID4-Promotor-Methylierung, Details s. Text. (Mit Genehmigung aus [17])

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Abb. 3
figure 3

Kohärenz der ID4-Promotor-Methlyierung und der ID4-Expression in 3 repräsentativen Proben von primären Mammakarzinomen (T) und ihren korrespondierenden Normalgeweben (N), MSP: ID4-Methylierungsstatus, mRNA-FC: ID4-mRNA-Expression, Gewebeproben: immunohistochemischen Färbung mit einem ID4-Antikörper, Vergr. 400:1, a unmethylierter Tumor, im direktem Vergleich zu korrespondierendem Normalgewebe, nur marginal veränderte ID4-mRNA- und ID4-Protein-Expression, b,c methylierte Tumoren, deutlicher Verlust der ID4-mRNA- und ID4-Protein-Expression im Vergleich zu entsprechendem Normalgewebe, Details im Text. (Mit Genehmigung aus [17])

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Klinische Relevanz der ID4-Promotor-Methylierung für das humane Mammakarzinom

Korrelationsanalysen der ID4-Promotor-Methylierung mit klinisch-pathologischen Parametern von Mammakarzinompatientinnen wurden mit dem Fischer’s-Exakt-Test durchgeführt (Tab. 1). Ein hypermethylierter ID4-Promotor war hierbei signifikant mit einem positiven Lymphknotenstatus (p=0,030) und einem Verlust der ID4-mRNA-Expression (p<0,001) assoziiert. Es wurden keine Korrelationen zwischen rezidivfreiem Überleben und Gesamtüberleben mit dem Alter, der Tumorgröße, dem histologischen Grading/Typ bzw. dem Östrogen-/Progesteronrezeptorstatus gefunden. Der direkte Vergleich des RFS, des OS und des ID4-Methylierungsstatus ist in Tab. 2 zusammengefasst. Wir fanden ein erhöhtes Risiko für die Rezidivbildung bei Mammakarzinompatientinnen mit positiver ID4-Promotor-Methylierung (p=0,036), verglichen mit Patientinnen ohne ID4-Methylierung: Erstere hatten eine geschätzte mittlere RFS-Zeit von 80 Monaten (95%-Konfidenzintervall: 67–93 Monate) verglichen mit 101 Monaten (95%-Konfidenzintervall: 87–115 Monate) bei Patientinnen ohne ID4-Methylierung (Abb. 2 b, [17]).

Die statistische Abschätzung erfolgte mittels Kaplan-Meier-Methode. Die ID4-Promotor-Methylierung war hierbei mit einer niedrigeren 10-Jahres-RFS-Rate von 47% assoziiert, während Patientinnen ohne ID4-Promotor-Methylierung eine 10-Jahres-RFS von 71% aufwiesen. Der ID4-Promotor-Methylierungsstatus erwies sich in einem multivariaten Cox-Regressionsmodell inklusive der Faktoren, welche das RFS beeinflussen könnten, als nicht signifikant (Daten nicht gezeigt). Ein Grund hierfür könnte die starke Assoziation zwischen der ID4-Methylierung und dem Risiko für Lymphknotenmetastasen sein.

Tab. 1 Klinisch-pathologische Parameter in Relation zur ID4-Promotor-Methylierung
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Tab. 2 Einfluss klinisch-pathologischer Parameter auf das Überleben von Brustkrebspatientinnen
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Diskussion

Es ist bekannt, dass der HLH-Transkriptionsfaktor ID4 funktionell mit fundamentalen Prozessen von Zellen wie Differenzierung, Proliferation, Apoptose und Angiogenese verknüpft ist [33] und mit Zellzyklusfaktoren wie dem RB1-Protein oder PAX-Proteinen interagiert [31]. Aus diesem Grund ist es nicht verwunderlich, dass eine Deregulierung von ID-Proteinen in verschiedenen Tumorentitäten gefunden wurde [18]. Die epigenetische Inaktivierung des ID4-Gens durch aberrante Promotorhypermethylierung konnte bereits für diverse humane Tumorentitäten gezeigt werden, wie für Karzinome des Magens [4] und des Dickdarms [25]. Für das humane Mammakarzinom wurde eine solche epigenetische Regulierung der ID4-Expression in 67% (16/24) der nodal-positiven Tumoren demonstriert, wobei sich die Analyse auf eine Subgruppe von T1-Tumoren beschränkte [26]. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit die Auswirkung einer aberranten ID4-Promotor-Methylierung anhand einer klinisch-relevanten Kohorte von Patientinnen mit primären humanen Mammakarzinomen sowie in verschiedenen humanen Brustkrebszelllinien analysiert werden.

Wir konnten durch ein In-vitro-Demethylierungsexperiment in humanen Brustkrebszelllinien zeigen, dass die ID4-Expression nach der ID4-Promotor-Demethylierung wiederhergestellt wird. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die ID4-Promotor-Methylierung ein zentraler Mechanismus für die Abschaltung des ID4-Gens in humanen Mammakarzinomen ist. Dieser Befund ist eine elementare Voraussetzung für eine mögliche tumorsuppressive Funktion des unmethylierten ID4-Gens in der humanen Brust. Bis jetzt konnte eine epigenetische Inaktivierung von ID4 nur für Karzinome des Magens [4] und des Dickdarms [25] gezeigt werden. In dieser Arbeit konnten wir belegen, dass auch ein hoher Prozentsatz von Mammakarzinomen (69%) eine aberrante ID4-Promotor-Methylierung aufweist. Ferner konnten wir zeigen, dass es zu einem hochsignifikanten Verlust der ID4-mRNA durch eine ID4-Promotor-Methylierung in 83% aller Brustkrebspatientinnen kommt. Diese Frequenz ist vergleichbar zu der bereits beschriebenen der ID4-mRNA-Herabregulierung in 78% der Fälle auf einer cDNA-Dot-Blot-Analyse [6]. Allerdings stehen unsere Ergebnisse im Widerspruch zu einer bereits berichteten ID4-mRNA-Heraufregulierung in Brustkrebszellen der Ratte [22].

Unsere statistischen Analysen verdeutlichten, dass es sich bei der ID4-Promotor-Methylierung um einen neuen, negativ-prognostischen Faktor handeln könnte. Brustkrebspatientinnen mit einem methylierten ID4-Promotor zeigten ein verkürztes RFS im direkten Vergleich zu Patientinnen ohne ID4-Promotor-Methylierung. Dieser Befund stützt wiederum unsere Hypothese, dass ein funktionelles ID4-Gen eine tumorsuppressive Funktion im humanen Brustgewebe ausübt. Somit könnte ID4 eine gegensätzliche zelluläre Funktion im Bezug zu ID1 und ID2 besitzen, denen eine onkogene Rolle in der humanen Brust zugesprochen wird [13, 16, 19]. Die statistische Auswertung unserer Kohorte von Brustkrebspatientinnen (n=170) zeigte eine enge Korrelation zwischen ID4-Promotor-Methylierung und dem Risiko für Lymphknotenmetastasen. Dieser Zusammenhang wurde ebenfalls für eine kleine Subgruppe von T1-Tumoren in der Studie von Umetani et al. [26] gefunden und weist auf eine metastasierungssuppressive Funktion von ID4 hin. Darüber hinaus wurden keine signifikanten Korrelationen zwischen der ID4-Promotor-Methylierung und anderen klinisch-pathologischen Parametern festgestellt.

Unserem Wissensstand nach ist die vorliegende Arbeit die erste Studie, welche einen deutlichen Verlust der ID4-Protein-Expression und der ID4-mRNA-Expression in Assoziation mit der ID4-Promotor-Hypermethylierung für das humane Mammakarzinom nachweisen konnte. Der Nachweis des Proteinverlusts, welcher letztendlich die Aktivität von Zielgenen moduliert, stellt ein wichtiges Ergebnis für die Validierung von ID4 als einem neuen Tumorsuppressorgen der humanen Mamma dar. Zuvor konnte zwar bereits ein ID4-Protein-Verlust in Mamma- [28] und kolorektalen Karzinomen [25] gezeigt werden, diese Studien wiesen aber nicht den Zusammenhang des Proteinverlusts zur Methylierung des ID4-Promotors nach.

Fazit für die Praxis

Unsere Daten sprechen dafür, dass ID4 ein neues putatives Tumorsuppressorgen der humanen Brust darstellen könnte, welches während der Kanzerogenese durch aberrante Promotorhypermethylierung inaktiviert wird. Positive ID4-Promotor-Methylierung stellt ferner einen möglichen prognostischen Marker für eine frühe Rezidivbildung des Mammakarzinoms dar und könnte somit als neuer Biomarker in der Behandlung von Brustkrebspatientinnen Verwendung finden. Unsere Untersuchungen bilden eine solide Basis für weiterführende funktionelle Analysen, mit dem Ziel, die Rolle von ID4 für die Progression und Metastasierung des humanen Mammakarzinoms weiter aufzuklären. Die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen durch aberrante Promotormethylierung bietet neue Möglichkeiten für die Identifizierung von DNA-basierten Biomarkern für humane Krebserkrankungen. So könnten DNA-Methylierungsmarkerpanels zukünftig eine verbesserte Krebsfrüherkennung, Risikoabschätzung, Chemoprädiktion und Kontrolle der Rezidivbildung ermöglichen, z. B. nach erfolgtem Nachweis dieser Biomarker in Körperflüssigkeiten wie Blut oder in archivierten Gewebeproben. Schließlich können solche Biomarker, aufgrund der Reversibilität von Methylierungsprozessen, möglicherweise in naher Zukunft auch als neue Zielmoleküle für effiziente Therapien dienen [10, 30].