Tissue-Engineering von Röhrenknochen mit einer vaskularisierten Matrix in einem Bioreaktor

Zusammenfassung

Ziel der Studie war die Herstellung und Testung eines vaskularisierten osteogenen Konstrukts.

Schweinejejunum mit venösem und arteriellem Gefäßstiel wurde mechanisch und chemisch azellularisiert. Das Kapillarsystem wurde mit humanen stromalen Zellen aus dem Knochenmark (hBMSC), das Lumen der Matrix mit hBMSC, die mit demineralisierter Knochenmatrix (DBM) oder flüssiger Schweinesubmukosa (SIS) vermischt wurden, besiedelt. Nach 3 und 6 Wochen Kultur in einem Perfusionsbioreaktor in separaten angiogenen und osteogenen Medien wurde der Gehalt an Osteokalzin (OC) und alkalischer Phosphatase (ALP), sowie die maximale relative Reißfestigkeit im Vergleich zu einer Kontrollgruppe bestimmt. Es wurde eine histologische Analyse mit v.-Willebrand-Faktor, UEA-1-Immunhistochemie, HE und v.-Kossa-Färbungen durchgeführt.

Das Kapillarsystem der Matrix zeigte eine Expression von Endothelzellmarkern. Die Aktivität der ALP war in den mit DBM besiedelten Gruppen nach 3 und 6 Wochen (2,2±1,0 und 2,4±0,6 U/l/µg Protein; p<0,05) und in den SIS-Gruppen nach 6 Wochen (1,8±0,9 U/l/µg Protein; p<0,03) erhöht. Die Osteokalzinsekretion war für die DBM-Gruppen nach 3 und 6 Wochen erhöht (23,5±21,1 und 11,1±4,5 ng/ml; p<0,05). Die Reißfestigkeit war für SIS und DBM nach 6 Wochen erhöht (15,1±3,7 N/mm² und 17,0±5,0 N/mm²; p<0,05). Die histologische Untersuchung zeigte die Bildung von Osteonen in den DBM- und SIS-Gruppen. Kalzifizierungen wurden in den DBM-Kulturen häufiger beobachtet.

Es gelang in vitro, das Kapillarsystem der Matrix mit angiogen differenzierten BMSC zu besiedeln. Die osteogene Besiedelung führte mit DBM und SIS zur mechanischen Festigung. Nach 3- und 6-wöchiger Kultur fanden sich in beiden zellbesiedelten Gruppen Osteone. Die osteogene Differenzierung war bei der Verwendung von DBM am höchsten.

Abstract

Background

The purpose of this study was to assess the feasibility of tissue engineering a vascular osteogenic construct.

Methods

The capillary system of a vascular biologic matrix (BioVaM) was seeded with human bone marrow stromal cells (hBMSC) that were differentiated in an endothelial cell-specific media. Within two layers of the vascular matrix, hBMSC were either cultivated with demineralized bone matrix (DBM) or liquefied small intestine submucosa (SIS). After 3 and 6 weeks in a perfusion bioreactor, endothelial cell phenotype and cell adherence were investigated with immunohistology. The contents of alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin (OC) were determined and a load to failure test was executed. Histologic differences were analyzed using H&E and von Kossa staining.

Results

The capillary system of the matrix stained positive for endothelial markers. ALP activity increased in DBM after 3 and 6 weeks (2.2±1.0 and 2.4±0.6 U/l/µg protein, p<0.05). Osteocalcin levels were highest for DBM (23.5±21.1 and 11.1±4.5 ng/ml, p<0.05). Tissue strength was enhanced in SIS and DBM after 6 weeks (15.1±3.7 N/mm² and 17.0±5.0 N/mm², p<0.05). Tissue morphology resembled osteons in DBM and SIS cultures; however, areas that stained positive for phosphate were more often found in the DBM group.

Conclusion

The capillary system of the matrix could be seeded with BMSC in vitro. Seeding of hBMSC mixed with DBM or SIS within a vascular matrix led to enhanced tissue strength and to osteon-like tissue structures. Osteogenic differentiation was highest when DBM was used.