Lagerung humaner nasaler Mukosa für die Einzelzell-Mikrogelelektrophorese

Zusammenfassung

Hintergrund. Um DNA-schädigende Potenziale von Umweltstoffen darzustellen, wird humane Mukosa eingesetzt, da sie unmittelbar exponiert ist und Entstehungsort maligner Entartungen sein kann.Da Mukosaproben in der Regel frisch aufgearbeitet werden und dieses Vorgehen logistische Probleme aufwerfen kann, berichten wir über Erfahrungen mit Kühl- und Gefrierlagerung von Nasenschleimhaut im Vergleich zur Frischverarbeitung.

Patienten und Methode. Frische hyperplastische Mukosa wurde sofort enzymatisch in Einzelzellen aufgetrennt, in Joklik-Medium über 24 h bei +4°C aufbewahrt oder bei −80°C gelagert. Für alle Zellen schloss sich eine Exposition mit Fremdstoffen oder Kontrollsubstanzen an.Zytotoxische Effekte wurden mit dem Trypanblauausschlusstest, genotoxische Effekte mit der alkalischen Einzelzellmikrogelelektrophorese quantifiziert.Mit dem Wilcoxontest wurde auf unterschiedliche Verteilungen des Migrationsverhaltens der DNA zwischen Sofortverarbeitung und Kühllagerung bzw.Gefrierlagerung geprüft.

Ergebnisse. Die Zellvitalitäten lagen zwischen 95% und 100%.Für alle Substanzen bis auf N-Nitrosodiethylamin waren die Fragmentwanderungen nach Kühllagerung oder Frischverarbeitung gleich. Nach Gefrierlagerung zeigten sich für die Kontroll- und Benzo[a]pyreninkubationen signifikant und für Natriumdichromat im Trend erhöhte Migrationen im Testsystem.Für die übrigen Stoffe ergaben sich keine Unterschiede in diesem Vergleich.

Schlussfolgerungen. Für Untersuchungen an Nasenschleimhautzellen mit der alkalischen Einzelzellmikrogelelektrophorese außerhalb eines festen Studienprotokolls erscheint eine 24-h-Lagerung im Nährmedium abhängig von der zu prüfenden Substanz legitim, eine Kryokonservierung in dem von uns verwendeten Ansatz jedoch nicht.

Abstract

Background. Human mucosal biopsies are established in ecogenotoxicological studies, but up until now they have demanded immediate processing after harvesting.We report our experience with the preservation of specimens either for 24 h at 4°C or for longer periods at −80°C and compare the results with fresh specimens using the alkaline single cell microgel electrophoresis assay.

Patients and methods. Nasal mucosa was harvested from ten patients, transferred to the laboratory and divided into groups for immediate processing,24 h preservation at 4°C and cryopreservation at −80°C. Alkaline single cell microgel electrophoresis assays were performed after separating the specimens into single cells and after exposure to benzo[a]pyrene,benzo[a]pyrene-diolepoxide, N-nitrosodiethylamine, or sodium dichromate. The trypan blue exclusion test was used to assess cytotoxicity.

Results. Despite of the fact that cell viability remained stable, after cryopreservation DNA-migration increased significantly for the negative control and benzo[a]pyrene.Although an increase was also seen for sodium dichromate, this was not significant.For benzo[a]pyrene-diolepoxide, N-nitrosodiethylamine and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine there were no significant changes in DNA-migration.After 24 h in cell medium at 4°C,DNA-migration did not rise compared to the samples which were immediately processed.

Conclusions. Preservation of mucosal specimens at 4°C for 24 h may be legitimate in order to facilitate laboratory practice.However, cryopreservation should not be applied because it leads to higher rates of DNA migration in some tested substances in the alkaline single cell microgel electrophoresis assay.