In-vivo-Applikation aufgereinigter Überstände fetaler und postnataler Osteoblastenkulturen: Erste Ergebnisse

Zusammenfassung

Mit zunehmenden Alter eines Organismus nimmt das knöcherne Regenerationspotenzial ab. Auch Osteoblasten in vitro zeigen mit zunehmendem Alter ein verändertes Wachstumsverhalten. Osteoblastenkulturen älterer Donoren, welche unter Standardbedingungen kein Wachstum zeigen, können jedoch durch Supplementation mit dem Mediumüberstand serumfrei inkubierter Osteoblastenkulturen fetalen Ursprungs zu einem ¶mit jüngeren Kulturen vergleichbaren Wachstum angeregt werden. Ziel dieser Arbeit war die In-vivo-Überprüfung dieses vom Donorenalter abhängigen In-vitro-Effekts. Dazu wurden von fetalen und postnatalen Rattenschädeln durch enzymatische Inkubation Osteoblastenkulturen etabliert und durch RT-PCR von Kollagen Typ I und Osteocalcin phänotypisch dokumentiert. Die Kulturüberstände wurden gepoolt und gleiche Volumina mittels RP-Chromatographie und Batch-Elution aufgereinigt. Das aufgereinigte Medium wurde auf Kollagenkissen aufgetragen und in Critical size defects der Rattencalvaria implantiert. Während in einer Kontrollgruppe, welche mit isotoner Kochsalzlösung behandelt wurde, radiologisch und histologisch keine Knochenregeneration beobachtet werden konnte, zeigte sich in den mit postnatalem Medium behandelten Defekten eine geringfügige und in den mit fetalen Überständen behandelten Defekten eine deutliche Knochenregeneration mit der Folge einer kompletten Defektüberbrückung. Diese Experimente bestätigen die grundsätzliche Möglichkeit, durch die Applikation aufgereinigter Osteoblastenkulturüberstände in Knochendefekten jenseits des autogenen spontanen Regenerationspotenzials eine vollständige Defektregeneration zu erzielen. Dabei spielt der Altersfaktor des Donororganismus im Hinblick auf die osteogene Potenz der Kulturüberstände eine bestimmende Rolle. Durch weiterführende Aufreinigungsschritte konnten mittels MALDI zahlreiche qualitative Unterschiede im Hinblick auf die Peptidzusammensetzung der fetalen bzw. postnatalen Osteoblastenkulturüberstände detektiert werden.

Summary

With increasing age of an organism, the osseous regenerative potential is reduced. In osteoblast-like cell cultures, cells of older donors that would not proliferate under standard conditions start to proliferate and express a differentiated phenotype when supplemented with the supernatant of fetal osteoblast-like cultures. The aim of this study was an evaluation of the fetal supernatant actions in vivo. Rat calvaria-derived osteoblasts of fetal and 21-day-old donors were isolated enzymatically and cultured. Their osteoblastic phenotype was confirmed by the expression of typical osteoblast synthesis products. The supernatant of the cultures of each age group was collected and pooled. The supernatant was purified by HPLC and concentrated approximately ten times. Additionally, several age-dependent differences within the purified protein fractions were documented by MALDI. After resuspension, the purified supernatant proteins were transferred on a collagen carrier and implanted into critical size defects of the calvaria of adult Wistar rats. In a control group, the collagen carriers were implanted containing isotonic salt solution. After 2, 4, and 8 weeks, a radiographic and histologic analysis of the regeneration process was performed which revealed differences in the progress of mineralization. The methods used in this study might help to identify age-dependent differences regarding the osteoblastic synthesis of osteoanabolic peptides and their impact on the regeneration of osseous defects.