Zytokininduzierte Stickstoffmonoxidproduktion von Gelenkknorpelzellen unter kontinuierlicher passiver Bewegung

Zusammenfassung

Fragestellung: In den letzten Jahren wurde Stickstoffmonoxid (NO) zunehmend als bedeutender Mediator entzündlicher und degenerativer Kiefergelenkerkrankungen erkannt. Ziel dieser Studie war die Evaluierung des Effekts von kontinuierlicher passiver Bewegung auf die Bildung von induzierbarer Stickstoffoxidsynthase (iNOS) in Interleukin-1(IL-1)-sensitiven Gelenkknorpelzellen. Material und Methode: Chondrozyten wurden von Kaninchengelenken gewonnen, auf Flexercell-Kulturplatten übertragen und folgenden 4 Versuchsgruppen zugeordnet: (1) kein mechanischer Stress (10 Hz, 20% Dehnung); ¶(2) rhIL-1β (1 ng/ml); (3) mechanischer Stress; (4) mechanischer Stress und ¶rhIL-1β. Nach 24 h wurden die Chondrozyten mittels Trypsin und Zentrifugation auf Objektträger aufgebracht. Die Gegenwart von iNOS wurde mittels indirekter ¶Immunperoxidasefärbung bestimmt und quantifiziert. Zusätzlich wurde mittels Greiss-Reaktion die NO-Produktion spektrophotometrisch in den Zellüberständen gemessen und RNA extrahiert, um mittels Reverser-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) die Expression von ¶mRNA-iNOS festzustellen. Alle Experimente wurden 3-mal wiederholt und die statistische Signifikanz mit dem Student-t-Test ermittelt. Ergebnisse: In der Kontrollgruppe ohne mechanischen Stress (1) und unter mechanischem Stress allein (3) konnte iNOS nicht nachgewiesen werden. Unter (rh)IL-1β-behandelten Chondrozyten (2) fand sich die intensivste Anfärbung (35%), während die zusätzliche ¶Gegenwart von mechanischem Stress (4) eine deutlich geringere Anfärbung zeigte (24%). Dies korreliert mit statistisch signifikant verschiedenen NO-Messwerten (p < 0,05) in den 4 Experimentgruppen und bestätigt iNOS-mRNA-Resultate. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse belegen die antientzündliche Wirkung kontinuierlicher passiver Bewegung auf IL-1-sensitive Gelenkknorpelzellen. Unter anderem liegt aus molekularbiologischer Sicht eine verminderte Menge an induzierbarer Stickstoffoxidsynthase (iNOS) in den Chondrozyten zugrunde. Die Fähigkeit von NO, als intrazelluläres, transzelluläres und zytotoxisches Molekül zu agieren, hat für die posttraumatische und postoperative Kiefergelenkfunktion sowie den Ablauf und damit die Therapie von Kiefergelenkerkrankungen grundlegende Bedeutung.

Summary

Purpose: The temporomandibular joint is a place of motion where release of proinflammatory cytokines like interleukin-1β (IL-1β) induces cartilage destruction via production of nitric oxide (NO). The purpose of this study was to evaluate the effects of continuous passive motion in the form of cyclic stretch on the synthesis of inducible nitric oxide synthase (iNOS). Methods: Articular chondrocytes were harvested from rabbit cartilage slices and cultured in F12 medium supplemented with 10% fetal calf serum. Subsequently, cells (10⁵/ml per well) were transferred to Flexercell plates, grown to 90% confluency, and subjected to one of the following regimens: (1) no mechanical strain (10 Hz, 20% elongation rate); (2) rhIL-1β (1 ng/ml); (3) mechanical strain; (4) mechanical strain and rhIL-1β. The cells were exposed to cyclic stretch for 24 h. Thereafter, cells were trypsinized and centrifuged on microscope slides in a cytospin centrifuge. The presence of iNOS was determined by indirect immunoperoxidase staining using polyclonal rabbit anti-iNOS as primary antibodies, and goat anti-rabbit IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) as secondary antibodies. Diaminobenzidine was used as substrate for HRP. Total NO production was spectrophotometrically measured in the supernatants of cultures using Greiss reaction. All experiments were done in triplicates and the statistical significance was analyzed by Student’s t-test. Results: Cells with treatment 1 and 3 did not exhibit presence of iNOS. IL-1β-treated cells in group 2 exhibited intense peroxidase staining. Cells in group 4 exposed to IL-1 and mechanical stress showed staining with considerably less intensity. Control cells treated with normal rabbit IgG as a primary antibody did not exhibit peroxidase staining. The data were further confirmed by measurement of statistically significant differences of NO levels in supernatants assessed in the four different treatment groups. Conclusion: Our findings suggest that continuous passive motion exerts anti-inflammatory effects on chondrocytes, downregulating the quantity of iNOS -positive cells. Since NO acts as an intracellular, transcellular, and cytotoxic molecule, it has a basic importance for proper post-traumatic and postoperative TMJ function as well as the course and therapy of inflammatory TMJ diseases.