Verfahren zum qualitativen Nachweis von Verotoxin-produzierendenEscherichia coli (VTEC) in Lebensmitteln und Fäzes

Zusammenfassung

Für den Nachweis von VTEC in Lebensmitteln und Fäzes wird ein Verfahren vorgestellt, das nach optimierter Anreicherung sowohl einen sensitiven VT-Screening-Schritt (alternativ ELISA oder PCR) als auch eine Methode zur gezielten Isolierung der VTEC beinhaltet. Die VT-positiven Isolate müssen dann nach biochemischer Bestätigung als E. coli und Serologie-molekularbiologisch auf zusätzliche Virulenzmarker untersucht werden. Als geeignetes Anreicherungsmedium für Lebensmittel und Fäzes stellte sich mTSB heraus. Das Schütteln der Kulturen und der Mitomycin-C-Zusatz erhöhten die Nachweisempfindlichkeit für VT erheblich. Für das VT-Screening aus der 18h-Kultur sind der selbstentwickelte VT-Rezeptor-ELISA»BgVV«, der kommerzielle Premier-EHEC und die PCR (MK1/MK2) alternativ einsetzbar. Für VT-positive Proben schließt sich die gezielte serovarunabhängige Isolierung mittels VT-Kolonie-Immunoblot an. Die Isolierungsrate liegt bei über 90 %. Für den Spezialfall EHEC O157 wird eine Kombination dieser Methode mit der Immunomagnetischen Separation (IMS) empfohlen.

Die Nachweisgrenze des Gesamtverfahrens liegt bei etwa 10 KbE/25 ml oder 25 g Lebensmittel. Reproduzierbare Ergebnisse wurden auch erreicht, wenn die Proben vor Untersuchung eingefroren bzw. kühl gelagert wurden (Milch>8 d bei −20 °C, Hackfleisch 14 d bei −20 °C, Kot>8 d bei +4 °C). Weichkäse und Rohwurst sollten sofort untersucht werden.

Summary

A procedure for the detection of VTEC in foods and faeces is presented. This procedure includes an optimized enrichment, sensitive VT-screening tests by using ELISA or PCR and a specific isolation of VTEC/EHEC. The VT-positive isolates must be confirmed as E. coli by means of biochemical methods. Furthermore serotype and other virulence factors have to be detected.

A suitable nutrient medium for VTEC-enrichment in foods and faeces is mTSB. Shaking and addition of Mitomycin C to the nutrient medium increase the sensitivity of VT-detection considerably. The self-developed VT-receptor-ELISA»BgVV«, the commercial available Premier-EHEC and PCR (MK1/MK2) are alternatively applicable for VT-screening after enrichment. In case of VT-positive samples a specific serovare-independent isolation by using of VT-Colony-Immunoblot is following. The isolation rate is more than 90 %. A combination of this method with the immunomagnetic separation (IMS) is recommended in case of EHTEC O157. The detection limit of the whole procedure is approximately 10 CfU/25 ml or 25 g of foods. Reproducible results are also found after deepfreezing or storing samples in refrigerator before testing (milk>8 d at −20 °C, minced meat>14 d at −20 °C, feacal samples>8 d at +4 °C). Soft cheeses and raw sausages have to be examined immediately without storage.