Temperature-induced conformational changes in turtle myoglobin

Summary

A sea turtle myoglobin has been spin labelled in the cyanomet form (MbT-CN) with a maleimide spin label and temperature-induced changes were monitored by EPR. The EPR spectrum is composed by an immobilized and a more mobile signal. Comparison of this spectrum with spectra obtained from other proteins, blocking of the NH₂-terminal and titration of SH groups lead to the conclusion that a reactive histidine is involved in the spin labelling. Our results on the temperature-induced changes monitored by the maleimide spin label suggest that a sequence of events is taking place in the transition which leads to protein denaturation (predenaturation): with increase in temperature atpH 8.5 the EPR parameter for the immobilized signal (α _EPR) is the first to report the structural change (T _1/2=28°C); then the mobile signal changes (T _1/2=44°C) and finally the active centre monitored by optical absorption of the iron heme undergoes these changes (T _1/2=64°C). The activation energy calculated from the mobile spectrum is around 3 kcal/mol showing that these changes are quite subtle if compared to the enthalpy changes monitored by optical absorption of iron (40 kcal/mol). This predenaturation occurring in the range (30÷50)°C seems to be a general property of myoglobins, as has been observed also for whale and applysia.

Riassunto

La mioglobina di tartaruga marina è state marcata con spin label maleimida nella forma cianometa (MbT-CN) e cambiamenti di temperatura sono stati indotti e accompagnati per EPR. Lo spettro di EPR è composto da un segnale fisso e un’altro piú mobile. Comparazioni di questo spettro con altri ottenuti da altre proteine, bloccando l’NH₂ terminale e titolando il gruppo SH, mettono in evidenza che un’istidina reattiva partecipa alla marcazione dello spin label. I nostri risultati nei cambiamenti di temperatura indotti e accompagnati dallo spin label indicano che la sequenza di fatti ha indotto una transizione che porta alla denaturazione della proteina (predenaturazione): con aumento della temperature apH=8.5, il parametro di EPR per il segnale fisso (α _EPR) è il primo a rivelare il cambiamento strutturale (T _1/2=28°C), allora il segnale mobile si modifica (T _1/2=44°C) e infine il centro attivo accompagnato per l’assorbimento ottico del ferro subisce questo cambiamento (T _1/2=64°C). L’energia di attivazione calcolata per lo spettro mobile è intorno di 3 kcal/mol indicando che questo cambiamento è piccolo quando comparato con la variazione di entalpia ottenuta per l’assorbimento ottico del ferro (40 kcal/mol). Questa predenaturazione che avviene nella fascia da 30 a 50°C sembra essere una proprietà comune delle mioglobine, come è stato osservato anche per la mioglobina di balena e di aplisia.

Резюме

В миоглобин морской черепахи вводится спиновая метка в форму (MbT-CN) и методом EPR контролируются термоиндуцированиые изменения. Спектр EPR составляют неподвижные и более подвижные сигналы. Сравнение этого спектра со спектрами других белков, блокирование концевой NH₂-группы и титрование SH-групп приводит к выводу, что помечены активные гистидины. Наши результаты по наблюдению за термоиндуцированными изменениями дают возмож-ность предположить, что имеет место последовательность событий в процессе перехода, который приводит к денатурации белка (пред-денатурация): с увеличением температуры приpH=8.5 параметр EPR для неподвижного сигнала (α _EPR) первым регистрирует структурное изменение (T _1/2=28°C); затем изменяется подвижный сигнал (T _1/2=44°C) и, наконец, претерпевает изменения активный центр, который мониторируется за счет оптического поглощения в железе (T _1/2=64°C). Энергия активации, вычисленная на основе подвижного спектра, составляет примерно 3 ккал/моль. Это указывает на то, что указанные изменения являются весьма тонкими по свавнению с изменениями энтальпии, которая мониторируется за счет оптического поглощения в железе (40 ккал/моль). Эти явление пред-денатурации, которое наблюдается в области (30÷50)°C, по видимому, представляет общее свойство миоглобинов.