Mutational studies onPhytophthora infestans

Summary

Attempts were made to induce and isolate auxotrophic mutants ofPhytophthora infestans, using ultra-violet light and ethyl methane sulphonate as mutagens. Low doses of ultra-violet light had little effect on the germination of the spore but markedly reduced the number of spores forming colonies and the growth rate of these colonies. Ethyl methane sulphonate did not affect the growth rate of the surviving colonies. No auxotrophic mutants were isolated but differences were noted in the ability of some survivors to initiate growth on the minimal medium, although once growth was established the colonies grew quite readily.

Zusammenfassung

Es wurden Versuche angestellt, um auxotrophe Mutanten vonPhytophthora infestans zu erhalten, inden man die Zoosporen entweder mit ultra-violettem Licht oder mit Methylsulfonsäure aethylester behandelte. Für die Schaffung von Einzelsporenkolonien von Zoosporen wurde ein Pektin-Glukose-Nährmedium verwendet. Der Prozentsatz an Zoosporen, die ihr Wachstum auf diesem Nährboden über das Stadium der Sporenbildung hinaus fortsetzten, änderte mit dem Isolat. Für den in diesen Versuchen verwendeten Klon betrug er ungefähr 15%.

Behandlung mit ultraviolettem Licht während 20 sec verminderte den Prozentsatz der Anzahl Kolonien bildender Sporen nicht, obwohl die Wachstumsrate dieser Kolonien etwas geringer war als jene von unbehandelten Kulturen. UV-Bestrahlung während 40 sec setzte die Zahl der Kolonien bildenden Sporen um ungefähr 99% herab (0,1 bis 0,7% der ausgesäten Sporen bildeten Kolonien) und reduzierte auch deutlich die Wachstumsrate der überlebenden Kolonien. Sporen, die während 60 sec bestrahlt wurden, bildeten keine Kolonien. UV-Bestrahlung bis zu 60 sec hatte nur sehr geringen Einfluss auf die Keimfähigkeit der Sporen, und um die Keimung vollständig zu unterbinden, war eine Bestrahlungsdauer von etwa 4 min nötig. Behandlung mit Methylsulfonsäure aethylester hatte keinen nennenswerten Einfluss auf die Wachstumsrate der überlebenden Kolonien.

Ungefähr 2.000.000 Sporen wurden mit ultraviolettem Licht und etwa 3000 Sporen mit Methylsulfonsäure aethylester behandelt. Gesamthaft wurden 545 überlebende Sporen der erstgenannten Behandlungsart und 155 überlebende Sporen der Behandlung mit Methylsulfonsäure aethylester isoliert und auf Mutation hinsichtlich Auxotrophie untersucht, indem bestimmt wurde, ob sie auf dem Minimal-Medium wuchsen. Alle überlebenden Sporen wuchsen möglicherweise auf dem Minimal-Medium, obwohl dies bei vielen Überlebenden der Behandlung mit ultravioletter Bestrahlung erst nach einer langen Verzögerung oder in einigen Fällen nach einer bis zu drei Monaten dauernden Wachstumsperiode auf Bohnen-Agar eintrat. Als Inokulum für diese Versuche wurden mit Myzelium infizierte Agar-Würfel (0,5 mm³) verwendet, die vom Rand der wachsenden Kulturen geschnitten wurden. Alle nicht wachsenden Isolate reagierten, wenn dem Minimal-Medium eine vollständige Mischung von Aminosäuren beigefügt wurde, sie wuchsen aber nicht, wenn der Nährboden mit einer grösseren Anzahl einzeln zugefügter Aminosäuren ergänzt wurde oder wenn Mischungen von Vitaminen oder Nukleinsäuren beigefügt wurden. Alle geprüften nichtwachsenden Sporen gediehen gut auf dem Minimal-Medium, wenn bei Beginn der Kultur ein Inokulum von ungefähr fünffacher Grösse verwendet wurde. Dieses Wachstum wird nicht auf die mit dem Inokulum zugeführten zusätzlichen Nährstoffe zurückgeführt, denn selbst nach wenigstens sechs Abimpfungen auf dem Minimal-Medium hielt das Wachstum in unvermindertem Masse an, vorausgesetzt dass jede Abimpfung mit einem grossen Inokulum begonnen wurde. Auf diese Weise würden die anfänglich übertragenen Wachstumsfaktoren am Ende des Versuches beträchtlich geschwächt und in einem viel geringeren Grad vorhanden sein als in einem kleinen Inokulum, das von Kulturen auf Bohnen-Agar stammt. Es wird daher angenommen, dass das Ausbleiben des Wachstums auf eine durch Behandlung mit dem Mutagen hervorgerufene, nicht genetisch bedingte Schwächung der Fähigkeit der Isolate, das Wachstum mit einem kleinen Inokulum anzuregen, zurückzuführen ist, und nicht auf eine Mutation zur Auxotrophie.

Es wurden keine stabilen auxotrophen Mutanten isoliert, doch war die Zahl der untersuchten überlebenden Sporen zu klein, um irgendwelche Schlüsse ziehen zu können.

Résumé

Les auteurs ont fait des essais pour obtenir des mutants auxotrophiques dePhytophthora infestans en traitant les zoospores soit à la lumière ultra-violette soit à l'éthyl méthane sulfonate. Ils ont utilisé le milieu “pectine-glucose” pour la culture de colonies de simples zoospores. Le pourcentage de zoospores poursuivant leur croissance au-delà de la phase de sporulation sur ce milieu varie avec l'isolat; pour le clone utilisé dans les présentes expériences ce pourcentage était d'environ 15%.

Le traitement à la lumière ultra-violette pendant 20 sec n'a pas réduit le pourcentage de spores formant des colonies, cependant que la vitesse de de croissance de ces colonies a été légèrement moindre que celle des cultures non traitées. L'irradiation pendant 40 sec a réduit le nombre de spores formant des colonies de 99% approximativement (0,1 à 0,7% des spores des plaques formaient des colonies) et a diminué également d'une manière nette la vitesse de croissance des colonies survivantes; aucune colonie ne s'est formée à partir des spores traitées pendant 60 sec. Le traitement pendant plus de 60 sec a eu très peu d'effet sur la capacité germinative des spores, et une exposition pendant 4 min environ a été nécessaire pour inhiber complètement la germination. L'éthyl méthane sulfonate n'a montré aucun effet marqué sur la vitesse de croissance des colonies survivantes.

Les auteurs ont traité approximativement 2.000.000 de spores à la lumière ultraviolette et quelque 3000 spores à l'éthyl méthane sulfonate. Ils ont isolé 548 survivants du premier traitement et 155 du second, qui furent testés pour mutation auxotrophique par détermination de leur croissance sur un milieu minimal. Tous les survivants se sont développés sur le milieu minimal, quoique la croissance de beaucoup d'entr'eux traités à la lumière ultra-violette ne s'est manifestée qu'après une longue phase de retard ou, dans quelques cas, après une période de plus de trois mois de séjour sur agar-haricot. Comme inoculum pour ces tests, les auteurs ont utilisé des blocs d'agar, 0,5 mm³, infectés de mycélium et coupés dans la partie active des cultures. Tous les isolats qui ne se développaient pas ont réagi quand on a ajouté au milieu minimal un mélange complexe d'acides aminés, mais n'ont pas modifié leur croissance quand on a ajouté au milieu une grande série d'acides aminés donnés seuls, ou des mélanges de vitamines ou d'acides nucléiques. Tous les types testés ne se développant pas reprenaient une bonne croissance sur le milieu minimal quand on utilisait un inoculum d'environ cinq fois le volume normal pour commencer la culture. Les auteurs considèrent que cette croissance n'est pas due aux matières nutritives supplémentaires apportées avec l'inoculum parce que cette croissance continue à une vitesse non réduite même après au moins six transferts sur le milieu minimal, pourvu que chaque transfert se fasse avec beaucoup d'inoculum. En effet, les facteurs de croissance initialement apportés doivent être considérablement dilués à la fin de chaque expérience et sont présents en quantité beau-coup moindre que dans un petit inoculum pris de chaque culture agar-haricot. De sorte que les auteurs considèrent que le manque de croissance doit être attribué à une dégradation non génétique de la capacité des isolats d'initier la croissance à partir d'un petit inoculum, dégradation induite par le traitement mutagène, et non à une mutation auxotrophique.

Aucun mutant auxotrophique n'a été isolé mais le nombre de survivants testés est trop bas que pour permettre de tirer des conclusions.