Abstract
Acid glycosaminoglycans were studied from isolated chondrocytes in suspension and the extracellular matrix obtained by sequential trypsin and collagenase treatment of 15- to 17-day-old embryonic chick bone. After papain digestion and removal of the nucleic acids by treatment with DNAse and RNAse, the glycosaminoglycans were precipitated by CPC and isolated as their sodium salt. Analyses of the CP-glycosaminoglycan solubility properties with the microfractionation procedure of Antonopouloset al. (1964) showed intracellular glycosaminoglycans of predominantly lower molecular weight and/or charge density than those of extracellular matrix. On micro-zone electrophoresis, only a minor part of the isolated intracellular glycosaminoglycans showed a mobility similar to that of the chondroitin sulphate standards while the major part moved only half the distance of hyaluronic acid and showed broad tailing, indicating a low negative charge. This was considered to be due to loss of a regulatory influence of the removed matrix components upon glycosaminoglycan synthesis and to release of originally synthesized glycosaminoglycans into the medium. For the first time, a small amount of intracellular hyaluronic acid was shown by typical electrophoretic mobility.
Résumé
Les glycosaminoglycanes acides de chondrocytes isolés, en suspension, sont étudiés. La matrice extracellulaire est isolée par traitement successif à la trypsine et à la collagénase d'os d'embryons de poulet, âges de 15 à 17 jours. Après digestion à la papaïne et élimination des acides nucléïques par traitement à la DNAse et à la RNAse, les glycosaminoglycanes sont précipités par le CPC et isolés sous la forme de leur sel sodique. Les analyses des propriétés de solubilité du CP glycosaminoglycane par le microfractionnement d'Antonopoulos et coll. (1964) révèlent la présence de glycosaminoglycanes intracellulaires de poids moléculaire et/ou de densité de charge nettement plus faibles que ceux de la matrice extracellulaire. Sur des électrophorèses de microzones, une petite partie des glycosaminoglycanes intracellulaires isolées présente une mobilité similaire à celle des solutions témoins de sulfate de chondroitine, alors que la portion la plus importante ne se déplace qu'à mi-distance de l'acide hyaluronique et montre une large trainée, indiquant une faible charge négative. Ce fait semble dû à une perte de l'influence de régulation des composants matriciels éliminées, sur la synthèse des glycosaminoglycanes et au rejet dans le milieu de glycosaminoglycanes initialement synthétisé. Pour la première fois, une faible quantité d'acide hyaluronique intracellulaire est mise en évidence par une mobilité électrophorétique typique.
Zusammenfassung
Saure Glykosaminoglycane von isolierten Chondrocyten in Suspension wurden untersucht, und die extracelluläre Matrix von 15–17 Tage alten Knochen von Kükenembryos wurde durch die aneinanderfolgende Behandlung mit Trypsin und Collagenase erhalten. Nach der Papain-Verdauung und Beseitigung der Nucleinsäuren mittels DNS- und RNSase-Behandlung wurden die Glykosaminoglycane mit CPC gefällt und als Natriumsalz isoliert. Untersuchungen der Löslichkeit der CP-Glykosaminoglycane mittels des Mikrofraktionierungsverfahrens von Antonopouloset al. (1964) zeigten intracelluläre Glykosaminoglycane mit meist niedrigerem Molekulargewicht und/oder niedrigerer Ladungsdichte als diejenigen der extracellulären Matrix. In der Mikro-Zonen-Elektrophorese zeigte nur ein kleiner Teil der isolierten intracellulären Glykosaminoglycane eine Mobilität, die dem Standard des Chondroitinsulfats entsprach. Der größte Teil legte nur die halbe Distanz der Hyaluronsäure zurück und zeigte breites “Tailing”, was auf eine niedrigere negative Ladung hindeutet. Die Ursache dafür wurde interpretiert als Verlust eines regulierenden Einflusses der entfernten Matrixkomponenten auf die Glykosaminoglycan-Synthese und als Abgabe ursprünglich synthetisierter Glykosaminoglycane in das Medium. Es wurde erstmals, anhand der typischen elektrophoretischen Beweglichkeit, eine kleine Menge von intracellulärer Hyaluronsäure nachgewiesen.
Similar content being viewed by others
References
Abbott, J., Holtzer, H.: The loss of phenotypic traits by differentiated cells. 3. The reversible behavior of chondrocytes in primary cultures. J. Cell Biol.28, 473–487 (1966)
Antonopoulos, C. A., Gardell, S., Szirmai, J. A., De Tyssonsk, E. R.: Determination of glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) from tissues on the microgram scale. Biochim. biophys. Acta (Amst).83, 1–19 (1964)
Fitton Jackson, E.: Environmental control of macromolecular synthesis in cartilage and bone: morphogenetic response to hyaluronidase. Proc. roy. Soc. B175, 405–453 (1970)
Handley, C. J., Phelps, C. F.: The biosynthesisin vitro of chondroitin sulphate in neonatal rat epiphyseal cartilage. Biochem. J.126, 417–432 (1972)
Hardingham, T. E., Muir, H.: The specific interaction of hyaluronic acid with cartilage proteoglycans. Biochim. biophys. Acta. (Amst.)279, 401–405 (1972)
Huffer, W. E.: Glycosaminoglycans in the cartilage of developing chick embryo limbs. Calc. Tiss. Res.6, 55–69 (1970)
Kuettner, K. E., Eisenstein, R., Soble, L. W., Arsenis, C.: Lysozyme in epiphyseal cartilage. IV. Embryonic chick cartilage lysozyme — Its localization and partial characterization. J. Cell Biol.49, 450–458 (1971)
Kuettner, K. E., Guenther, H., Ray, R. D., Schumacher, G. F. B.: Lysozyme in preosseous cartilage. Calc. Tiss. Res.1, 298–305 (1968)
Larsson, S.-E.: The metabolic heterogeneity of glycosaminoglycans of the different zones of epiphyseal cartilage. In manuscript, 1973.
Larsson, S.-E., Lemperg, R. K.: The glycosaminoglycans of the different layers of bovine articular cartilage in relation to age. II. Incorporation of35S-sulphatein vitro into different fractions of chondroitin sulphate. Submitted for publication, 1973
Larsson, S.-E., Ray, R. D., Kuettner, K. E.: Microchemical studies on acid glycosaminoglycans of the epiphyseal zones during endochondral calcification. Calc. Tiss. Res.13, 271–285 (1973)
Laurent, T. C., Scott, J. E.: Molecular weight fractionation of polyanions by cetylpyridinium chloride in salt solutions. Nature (Lond.)202, 661–662 (1964)
Mathews, M. B.: In: Structure and function of connective and skeletal tissue, p. 181. Ed. Fitton Jackson, London: S. Butterworth 1965
Nameroff, M., Holtzer, H.: The loss of phenotypic traits by differentiated cells. IV. Changes in polysaccharides produced by dividing chondrocytes. Develop. Biol.16, 250–281 (1967)
Olsson, J., Gardell, S.: Isolation and characterization of glycosaminoglycans from human leukocytes and platelets. Biochim. biophys. Acta (Amst.)141, 348–357 (1967)
Puch, T. T., Cieciura, S. J., Robinson, A. J.: Genetics of somatic mammalian cells. III. Long term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J. exp. Med.108, 945–953 (1968)
Revel, J.-P.: In: Chemistry and molecular biology of the intercellular matrix, p. 1485. Ed. E. A. Balazs. London-New York: Academic Press 1970
Robinson, H. C., Dorfman, A.: The sulphation of chondroitin sulphate in embryonic chick cartilage epiphyses. J. biol. Chem.244, 348–352 (1960)
Scott, J. E.: Aliphatic ammonium salts in the assay of acidic polysaccharides from tissues. Meth. biochem. Anal.8, 145–197 (1960)
Seno, N., Anno, K., Kondo, K., Nagase, S., Saito, S.: Improved method for electrophoretic separation and rapid quantitation of isomeric chondroitin sulphates on cellulose acetate strips. Analyt. Biochem.37, 197–201 (1970)
Shulman, H. J.: Chemical expression of differentiated function by chondrocytes in cell culture. Fed. Proc.28, 897 (1969)
Shulman, H. J., Meyer, K.: Chondroitin-4-sulphate synthesis by differentiated chondrocytes in cell culture. Arthr. and Rheum.11, 510 (1968a)
Shulman, H. J., Meyer, K.: Cellular differentiation and the aging process in cartilaginous tissues. Mucopolysaccharide synthesis in cell cultures of chondrocytes. J. exp. Med.128, 1353–1362 (1968b)
Thorp, F. K., Dorfman, A.: The occurrence of intracellular chondroitin sulphate. J. Cell Biol.18, 13–17 (1963)
Author information
Authors and Affiliations
Additional information
Work supported by USPHS fellowship 1 F05 TW0 1674-01 and in part by USPHS grant AM 09132 and by a grant from the Swedish Medical Research Council No. B71-17Z-3286-01.
Rights and permissions
About this article
Cite this article
Larsson, SE., Kuettner, K.E. Microchemical studies of acid glycosaminoglycans from isolated chondrocytes in suspension. Calc. Tis Res. 14, 49–58 (1974). https://doi.org/10.1007/BF02060282
Received:
Accepted:
Issue Date:
DOI: https://doi.org/10.1007/BF02060282