Calcificationin vitro of demineralized bone matrix

Abstract

Collagen was prepared from compact sheep bone by decalcification with EDTA and from rat tail tendons by acetic acid extraction and reconstitution with NaCl. The deposition of apatite in sheep bone collagen in a metastable calcification solution was studied chemically and by electron microscopy. The bone collagen was shown to be a good nucleation catalyst for mineral deposition, while rat tail collagen was a poor catalyst. Mineral deposition in bone collagen occured in two separate kinetic phases, a rapid phase of nucleation and crystal growth, giving rise to small calcified islands, and a second slow phase, ascribed to growth in regions not involving the catalytic sites. This second phase of mineral deposition is considered to be the result of impaired ion diffusion through the closely-aligned collagen fibrils, thus leaving large areas of the collagen free of mineral even though the buffer remains highly supersaturated. Electron micrographs suggested that the catalytic sites might be in some relationship to the 640 Å periodicity of collagen, but a role for non-collagenous material bound to the collagen has not been excluded.

The poor catalytic activity of reconstituted collagen was not due to the presence of loosely-bound inhibitors, although inhibitors could be strongly bound to this type of collagen and be absent from bone collagen. The differences in catalytic activity may have a bearing on physiological calcification. A more general hypothesis for nucleation of a mineral phase in biological systems is required.

Résumé

Du collagène d'os compact de mouton est préparé par décalcification dans I'EDTA et à partir de tendons de queux de rats, par extraction dans l'acide acétique et reconstitution dans NaCl. Le dépôt d'apatite dans le collagène osseux de mouton dans une solution de calcification métastable est étudié chimiquement et par microscopie électronique. Le collagène osseux est un bon catalyseur de nucléation pour le dépôt minéral, alors que le collagène de tendons de rat ne l'est pas. Le dépôt minéral du collagène osseux se produit en deux phases cinétiques séparées, une phase rapide de nucléation et une croissance cristalline, donnant naissance à de petits ilots calcifiés et une seconde phase lente de croissance dans des régions ne comportant pas de zones catalytiques. La seconde phase de dépôt minéral paraît être le résultat d'une diffusion inhibée d'ions à travers les fibrilles collagènes alignées, laissant de larges régions de collagène sans minéral, bien que le tampon reste hautement sursaturé. La microscopie électronique permet de penser que les zones de catalyse pourraient avoir un rapport avec la périodicité de 640 Å de collagène, mais l'importance d'un matériel noncollagènique, lié au collagène, n'est pas à exclure.

L'activité catalytique faible du collagène reconstitué n'est pas liée à la présence d'inhibiteurs faiblement liés, bien que des inhibiteurs puissent être intimement liés à ce type de collagène, qui pourrait être absent du collagène osseux. La différence d'activité catalytique pourrait intervenir dans la calcification physiologique. Une hypothèse plus générale pour la nucléation de la phase minérale dans les systémes biologiques est nécessaire.

Zusammenfassung

Kollagen wurde aus kompaktem Schafsknochen mittels EDTA-Entkalkung und aus Rattenschwanzsehnen durch Essigsäureextraktion und Rekonstitution mit NaCl gewonnen. Die Apatitablagerung aus einer metastabilen Verkalkungslösung auf Schafsknochenkollagen wurde chemisch und im Elektronenmikroskop untersucht. Es zeigte sich, daß das Knochenkollagen ein guter Nukleationskatalysator für die Mineralablagerung ist, was beim Rattenschwanzkollagen nicht zutraf. Im Knochenkollagen erfolgte die Mineralablagerung in zwei getrennten kinetischen Phasen: einer raschen Phase der Nukleation und des Kristallwachstums, welche kleine verkalkte Inseln entstehen läßt, und einer zweiten langsamen Phase, welcher das Wachstum in Bezierken, die keine katalytischaktiven Stellen einschließen, zuzuschreiben ist. Diese zweite Phase der Mineralablagerung wird als Resultat einer verminderten Ionendiffusion durch die enganeinanderliegenden Kollagenfibrillen angesehen, wodurch weite Kollagenbereiche ohne Mineral bleiben, obwohl der Puffer stark übersättigt ist. Elektronenmikrographien ließen vermuten, daß die katalytischaktiven Stellen in einem gewissen Verhältnis zur 640 Å-Periodizität des Kollagens stehen; es konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß nicht-kollagenhaltiges Material, welches an Kollagen gebunden ist, ebenfalls eine Rolle spielt.

Die schlechte katalytische Aktivität des rekonstituierten Kollagens konnte nicht auf die Anwesenheit von schwachgebundenen Hemmstoffen zurückgeführt werden, obwohl Inhibitoren stark an dieses Kollagen gebunden sein könnten, die jedoch im Knochenkollagen nicht vorhanden sind. Die Unterschiede in der katalytischen Aktivität können mit der physiologischen Verkalkung in Beziehung stehen. Eine allgemeinere Hypothese für die Nukleation einer Mineralphase in biologischen Systemen wäre erforderlich.