Systemic infection of some N-gene-carrying Nicotiana species and cultivars after inoculation with tobacco mosaic virus

Abstract

Since July 1974Nicotiana tabacum ‘Samsun NN’ plants, inoculated with the common strain of tobacco mosaic virus (TMV), have occasionally been found to develop necrosis on non-inoculated upper leaves 2–7 days after the local necrotic lesions had appeared on the lower leaves. All these plants had been kept in a growth chamber at 17–20°C. Other tobacco species and cultivars carrying theN gene, such asN. glutinosa andN. tabacum ‘Xanthi-nc’, showed the same phenomenon. Substantial amounts of TMV could be recovered from leaves with systemic symptoms. The systemic necrosis somewhat resembled that caused by tobacco rattle virus (TRV). A number of possible causes, such as high concentration of the inoculum, contamination with another strain of TMV or with TRV, change in the genetic composition of the host plants and certain growing conditions (soil, water, pesticides) were investigated. None of these factors could be held fully responsible for the abnormal systemic reaction, although there was evidence that the soil could sometimes play an important rôle.

Samenvatting

Tabakssoorten en cultivars die hetN gen bevatten, zoalsNicotiana glutinosa, N. tabacum ‘Samsun NN’ enN. tabacum ‘Xanthi-nc’ vertonen gewoonlijk slechts lokale, necrotische lesies op de bladeren na inoculatie met tabaksmozaïekvirus (TMV).

In 1975 hebben Shimomura en Ohashi vermeld, dat necrotische lesies ontstonden op de niet-geïnoculeerde bovenste bladeren van planten vanN. glutinosa en ‘Samsun NN’, die acht dagen na inoculatie met TMV bij 20°C hadden gestaan. Daar ze in deze bovenste bladeren geen TMV konden aantonen, spraken deze auteurs van ‘non-viral lesions’. Al gedurende meer dan 10 jaar zijn in Wageningen ‘Samsun NN’-planten in een klimaatkamer bij 17–20°C gekweekt maar nooit werden dergelijke ‘non-viral lesions’ waargenomen.

In juli 1974 werden in Wageningen enkele ‘Samsun NN’-planten gevonden met chlorotische vlekjes, necrose op, en misvorming van, de bovenste bladeren, ongeveer een week nadat de lokale necrotische lesies waren verschenen op de met TMV geinoculeerde onderste bladeren (Fig. 1). In een paar weken tijd stierven de meeste van deze systemisch geïnfecteerde planten na sterke topnecrose af (Fig. 2). Al deze planten bevonden zich in een klimaatkamer bij temperaturen die varieerden van 17–20°C. Later werd een zelfde verschijnsel ook in een kas in Wageningen waargenomen. Van die tijd af is deze ongewone reactie van ‘Samsun NN’ op TMV altijd in meer of minder heftige mate opgetreden, zowel in de klimaatkamer als in de kas. In veel opzichten doen de systemische symptomen op ‘Samsun NN’ denken aan die, welke door tabaksratelvirus (TRV) op deze cultivar worden veroorzaakt.

Om dit verschijnsel te verklaren zijn de volgende hypotheses opgesteld:

• 1. Hoge concentraties van TMV in het inoculum verrorzaken systemische verspreiding (zg. dosis-effect).

• 2. Er is sprake van een mutant van TMV in het inoculum.

• 3. In de tabakssoorten zijn genetische veranderingen opgetreden.

• 4. Naast TMV is TRV aanwezig in de met TMV geïnoculeerde planten.

• 5. Bepaalde groeiomstandigheden van de planten zijn verantwoordelijk voor de systemische verspreiding.

Eerst zijn de reacties vanN. glutinosa en ‘Samsun NN’-planten op inoculatie met een zuivere suspensie van TMV-Wageningen vergeleken bij 18°C en 22°C. Zes dagen na inoculatie vertoonden de eerste ‘Samsun NN’-planten systemische necrose, en na 10 dagen verschenen op enkeleN. glutinosa-planten uit de serie van 22°C duidelijke, systemische, necrotische lesies en misvormingen (Fig. 3) en bij 18°C kleine, chlorotische vlekjes op de niet-geïnoculeerde bladeren (Fig. 4).

In enkele gevallen vertoonden ‘Samsun NN’-planten met hevige topnecrose regeneratie doordat nieuwe, gezond-uitziende scheuten zich uit okselknoppen ontwikkeld hadden, nadat de top van de hoofdstengel was afgestorven (Fig. 5).

In de topbladeren van systemisch-reagerendeN. glutinosa en ‘Samsun NN’-planten kon TMV worden aangetoond; sap uit laatstgenoemde topbladeren (T_S), geinoculeerd op jonge ‘Samsun NN’-planten gaf meer systemische infectie dan sap uit bladeren van ‘Samsun NN’-planten met lokale lesies (I_S).

Indooppreparaten van T_S gaven in de elektronenmicroscoop gebroken, TMV-achtige deeltjes te zien (Fig. 6).

Om te zien of het virus in de topbladeren verschilt van dat in de geïnoculeerde bladeren werd TMV gezuiverd uit T_S en I_S. Beide gezuiverde TMV-suspensies vertoonden het gewone UV-absorptie profiel en gaven in de elektronenmicroscoop veel gebroken virusdeeltjes te zien (Fig. 7A en B). De infectiositeit van beide gezuiverde suspensies, getoetst op afgeknipte bladeren vanN. glutinosa en hele planten van ‘Samsun NN’ was gelijk.

Bij enting van ‘Samsun NN’ enN. glutinosa-planten op ‘Samsun NN’ ofN. glutinosa en inoculatie van de onderstammen met TMV-Wageningen ontwikkelde zich systemische necrose na enting op ‘Samsun NN’ (Tabel 1).

Hypothese 1: Dosiseffect. Een serie van tienvoudige verdunningen met concentraties variërend van 1000 tot 0,01 μg/ml werd geïnoculeerd op ‘Samsun NN’-planten. Bij de drie hoogste concentraties vertoonden alle planten systemische necrose, bij de twee laagste gaf geen der planten een systemische reactie.

Hypothese 2: De aanwezigheid van een mutant van TMV. Achttien lokale-lesie isolaten, verkregen na vijf passages opN. glutinosa, gaven alle systemische infectie van ‘Samsun NN’-planten.

Tevens werd gewerkt met virus van verschillende herkomst. Tabakssap van negen merken sigaretten en een sigaar werd voor dit doel gebruikt. In acht van de negen series ‘Samsun NN’-planten verscheen systemische necrose (Tabel 2). Bij ‘Samsun NN’-planten geïnoculeerd met TMV-isolaten uit Tübingen, Baarn en Wageningen (Tabel 3) werden eveneens systemische reacties waargenomen.

Hypothese 3: Genetische verandering in tabakssoorten. Tabakszaad van verschillende herkomst, of van verschillende partijen van dezelfde herkomst, werd vergeleken. Planten vanN. glutinosa, ‘Samsun NN’ en ‘Xanthi-nc’ uit de V.S. werden geinoculeerd met een gezuiverde suspensie van TMV-Wageningen. In alle series verschenen systemisch-geïnfecteerde planten (Tabel 4). Bovendien werd ‘Samsun NN’-zaad dat in verschillende jaren (1964, 1968, 1971) was geoogst in de kas in Wageningen, getoetst. In alle drie series trad systemische necrose op.

Hypothese 4: De aanwezigheid van TRV. Sap uit T_S werd geïnoculeerd op een toetsplantenreeks waarop TMV en TRV konden worden onderscheiden. In geen van de toetsplanten werden de voor TRV-infectie typische symptomen waargenomen.

Dat TRV ook niet aanwezig was in de vorm van vrij TRV-RNA bleek uit het feit dat fenol-bentoniet extracten van systemisch geïnfecteerde delen van ‘Samsun NN’ evenmin als gezuiverd TMV-RNA lokale lesies veroorzaakten op ‘Bataaf’ bonen. Fenol-bentoniet extract uit planten met TRV gaf wel lokale lesies op dit bonenras (Tabel 5). Alle RNA-suspensies gaven op ‘Samsun NN’ systemische symptomen, die voor TRV-RNA overigens duidelijk verschilden van die van de overige inocula (Tabel 5, Fig. 8).

Hypothese 5: Groeiomstandigheden van de planten. Drie factoren zijn in beschouwing genomen, te weten grond, water en pesticiden.

Grond. ‘Samsun NN’-planten werden opgekweekt in grond van verschillende herkomsten. Een deel van deze proeven werd uitgevoerd in Wageningen met handelsgrond, een ander deel in Baarn met ter plaatse bereide grond. De planten die opgekweekt waren in grond uit Baarn hadden lichtere bladeren en stengels met veel langere internodiën dan de planten in de grond in Wageningen. In Baarn werd een serie ‘Samsun NN’ geïnoculeerd met een gezuiverde TMV-suspensie. Vier van de 25 planten gaven systemische necrose te zien in de kas, waar de temperatuur soms steeg van 24°C tot 26°C. Ter vergelijking werden gezonde ‘Samsun NN’-planten in potten overgebracht van Baarn naar Wageningen, waar zij werden verdeeld over de klimaatkamers van 18°C en 22°C en twee kassen. Alle planten werden geïnoculeerd met een gezuiverde suspensie van TMV-Wageningen. Na acht dagen vertoonden slechts enkele planten in de kassen systemische symptomen. In de klimaatkamers waren meer planten systemisch geïnfecteerd, maar ook hier was het aantal veel geringer dan bij planten opgekweekt in Wageningse grond.

Water. Daar de klimaatkamers in Wageningen hun water uit andere bron betrekken dan de kassen, en op beide plaatsen ‘Samsun NN’ enN. glutinosa-planten geïnfecteerd raakten, was het niet nodig water van nog andere herkomst bij de proeven te betrekken.

Pesticiden. De reacties van een serie ‘Samsun NN’-planten die bespoten waren met verschillende pesticiden zijn vergeleken met die van planten die nooit met pesticiden in aanraking waren geweest. In beide series kwamen evenveel systemisch-zieke planten voor.

Geen van de onderzochte factoren blijkt geheel verantwoordelijk te zijn voor optreden van de systemische reactie, al speelt de grond een belangrijke rol.