Development of a standard method for detection of potato spindle tuber viroid in potato plants

Abstract

A standard test method for detecting viroids was designed, to be applied on imported plant material, for which a zero-tolerance exists in the Netherlands towards potato spindle tuber viroid (PSTV).

Partial purification of nucleic acids after homogenizing leaf material with a Polytron homogenizer, followed by increasing the viroid concentration by inoculation of an intermediate tomato host, and complete purification of the small nucleic acids from the tops of these plants, followed by polyacrylamide gelectrophoretic analysis, proved successful. With this procedure, now used as a standard method, more samples could be handled than with other methods tested.

Desalting by Sephadex filtration proved to be superior to dialysis. An attempt to develop a serological test for PSTV failed. Albinism, induced in PSTV-infected tomato plants by certain environmental conditions, was not of diagnostic value.

Samenvatting

Voor het viroïde, dat de aardappelspindelknolziekte veroorzaakt (ASKV) geldt in Nederland een nultolerantie. Al het geïmporteerde aardappelmateriaal wordt daarom getoetst op het voorkomen van het viroïde. Voor dat doel is een betrouwbare en, zo mogelijk, ook snelle toets noodzakelijk, die niet alleen secundaire infecties maar ook jonge, primaire infecties kan aantonen.

Een standaardmethode, die werd ontwikkeld, bleek zeer betrouwbaar, hoewel niet snel. Zij toont meer infecties aan dan snellere methoden die in het buitenland beschreven zijn. De toets omvat de volgende stappen: 2–5 g bladmateriaal wordt vermalen en op het homogenaat wordt een eenvoudige nucleïnezuurextractie en-concentratie toegepast. Dit preparaat wordt gebruikt om vier jonge tomatezaailingen te inoculeren. Door deze zaailingen 4 weken onder optimale omstandigheden te houden wordt het eventueel aanwezige viroïde vermeerderd. Geeft tenminste één van de tomateplanten symptomen, dan wordt het oorspronkelijke monster ziek verklaard. Vertoont geen van de vier tomateplanten symptomen dan wordt een nucleïnezuurextractie uitgevoerd van de topjes van deze planten. Kleine nucleïnezuurmoleculen worden geïsoleerd, geconcentreerd en tenslotte geanaliseerd met behulp van polyacrylamide gelelektroforese.

Om overdracht van het ene naar het andere monster te voorkomen werd voor het vermalen gebruik gemaakt van verwisselbare schachten bij de Polytron homogenisator.

Ontzouten van de nucleïnezuurextracten met Sephadexfiltratie gaf betere resultaten en was sneller uitvoerbaar dan dialyse.

Pogingen om een specifiek antiserum tegen ASKV te maken zijn niet gelukt. Onder onze omstandigheden was het ook niet mogelijk om op een betrouwbare manier albinisme in geïnfecteerde planten te induceren als middel om infecties met ASKV op te sporen.