Microcalorimetric study of the binding of methotrexate and its metabolites to thymidylate synthase

Abstract

Direct microcalorimetric measurements allow determination of both the δH and association constant of biological complexes ifK _a value does not exceed 10⁶ M ⁻¹. For higherK _a values, δH can obviously be determined; this paper describes an original microcalorimetric method that permits determination of such high association constants. This method is based on the analysis of the competitive effect between two ligands having the same binding site in their receptor. As an example, the affinity constant for thymidylate synthase of a novel antifolate, CB 3717. was found to be 1.4 · 10⁷ M ⁻¹ using methotrexate polyglutamate MTX-G2 (K _a=2.3·10⁵ M ⁻¹) as competitor.

Zusammenfassung

Direkte mikrokalorimetrische Messungen erlauben, sowohl die Bildungsenthalpie δH wie auch die GleichgewichtskonstanteK _a biologischer Komplexe zu bestimmen, sofern derK _a-Wert 10⁶ M ⁻¹ nicht übersteigt. Für höhereK _a-Werte kann δH durchaus direkt ermittelt werden. In dieser Arbeit wird eine neuartige mikrokalorimetrische Methode beschrieben, die auch eine Bestimmung sehr hoherK _a -Werte zulÄsst. Diese Methode fusst auf der Analyse eines kompetitiven Effekts zweier Liganden, welche die gleiche Bindungsstelle am Rezeptor besetzen können. Als Beispiel wirdK _a für die Bindung eines neuen FolsÄureantagonisten, CB 3717, an Thymidylat Synthase, unter Verwendung von Methotrexat Polyglutamat MTX-G2 als kompetitiver Ligand, bestimmt.