Characterization of trypsin immobilized on oxirane-acrylic beads for obtaining phosphopeptides from casein

Summary

The aim of the study was to characterize the proteolytic properties of immobilized trypsin for obtaining phosphopeptide-rich fractions from casein. Trypsin was covalently bound to oxirane-acrylic beads. After incubation for 48 h immobilization degrees of about 85 % were achieved. 20 % of the immobilized enzyme exhibited no activity towards the substrate N-benzoyl-L-arginine ethyl ester.

Compared with homogeneous catalysis with the soluble enzyme a 25 % lower degree of proteolysis was calculated and a modified peptide pattern of the resulting proteolysates established. A caseinophosphopeptide (CPP) from α_s1-CN (59–79) was not detectable after incubation with the carrier-bound enzyme.

At a substrate concentration (S) of 15 % (w/w) substrate saturation of the enzyme (E) was achieved. Increasing the substrate concentration to 20 % (w/w) decreased the conversion rates (content of soluble amino-N) and the liberation of CPPs. Proteolysis of small (1 % w/w) and partly also large (20 % w/w) substrate concentrations (E/S=1/100) is subject to changed kinetic conditions. The same was true for small and large enzyme concentrations (S=5 % w/w). Compared with enzyme saturation (E/S=1/50), lack of enzyme (E/S=1/800) led to a disproportional decrease in the proteolysis rate and to a markedly decreased content of hydrophobic peptides in the resulting proteolysates. Increasing the pH from 7.8 to 8.8 and the temperature from 37 ° to 47 °C caused only a slight increase in conversion rates, but an overproportional liberation of CPPs (pH 8.8=+47 %, 47 °C=+89 %), in particular from β-casein. Repeated use of immobilized trypsin resulted after nine runs in a loss in proteolytic activity and in CPP yields of approximately 25 %, while the peptide pattern of the proteolysates remained qualitatively unchanged. Light microscopy shows that the oxirane-acrylic beads disintegrate to a large extent after nine repetitions.

Zusammenfassung

Gegenstand der Arbeit war die Charakterisierung der proteolytischen Eigenschaften von immobilisiertem Trypsin in der Gewinnung phosphopeptidreicher Fraktionen aus Casein. Trypsin wurde kovalent an Oxiran-Acrylharzperlen gebunden. Nach 48stündiger Inkubation wurden Immobilisierungsgrade um 85 % erreicht. 20 % des immobilisierten Enzyms wies gegenüber dem Substrat N-Benzoyl-L-Arginin-Ethyl-Ester keine Aktivität auf.

Im Vergleich zur homogenen Katalyse (gelöstes Enzym) wurde ein um 25 % geringerer Proteolysegrad errechnet und ein verändertes Peptidmuster der resultierenden Proteolysate festgestellt. Ein Caseinophosphopeptid (CPP) aus α_s1-CN (59–79) war nach Inkubation mit dem trägergebundenen Enzym nicht nachweisbar.

Bei einer Substratkonzentration von 15 % (w/w) wurde Substratsättigung des Enzyms erreicht. Eine Erhöhung auf 20 % (w/w) führte zu einem Abfall der Umsatzraten (Gehalt an löslichem Amino-N) und einer verringerten Freisetzung an CPPs. Die Proteolyse bei geringen (1 % w/w) und punktuell auch bei hohen (20 % w/w) Substratkonzentrationen (E/S=1/100) unterliegt veränderten kinetischen Bedingungen. Der gleiche Sachverhalt wurde bei geringen bzw. hohen Enzymkonzentrationen (S=5 % w/w) festgestellt. Enzymmangel (E/S=1/800) führte — im Vergleich zur Enzymsättigung (E/S=1/50) — zu einer unproportionalen Abnahme der Proteolyserate und zu einem deutlich verringerten Gehalt an hydrophoben Peptiden in den resultierenden Proteolysaten. Die Erhöhung des pH-Wertes von 7,8 auf 8,8 bzw. der Temperatur von 37 °C auf 47 °C führte zwar nur zu einer geringen Steigerung der Umsatzraten, aber zu einer überproportionalen Freisetzung an CPPs (pH 8,8=+47 %, 47 °C=+89 %), insbesondere aus β-Casein. Die Mehrfachnutzung des immobilisierten Trypsins ergab nach neunfacher Anwendung einen Verlust der proteolytischen Aktivität und der Ausbeute an CPPs von ca. 25 %, das Peptidmuster der Proteolysate blieb aber qualitativ unverändert. Lichtmikroskopische Aufnahmen haben gezeigt, daß die Oxiran-Acrylharzperlen nach neunfacher Anwendung weitestgehend zerbrochen waren.