Thyroxin-bindendes Globulin (TBG): Präparation, radioimmunologische Bestimmung und klinisch-diagnostische Bedeutung

Summary

In order to establish a direct method for the determination of thyroxine-binding globulin, the preparation of TBG was performed by five subsequential chromatographical steps: first, TBG was concentrated 640-fold from pooled human serum by affinity chromatography on agarose to which triiodothyronine was covalently bound over six carbon long spacer groups using the bromine cyanide activation method. The further purification was performed by anion exchange chromatography on QAE- and DEAE-Sephadex A-50, and affinity chromatography for glycoproteins on ConA-Sepharose. The final enrichment of TBG was 4500 fold, the overall yield was approximately 20%. This preparation was shown to be highly purified by disc electrophoresis (three different concentrations of polyacrylamide and two different pH values) and by equimolar binding for T₄ and T₃. Microheterogeneity was shown by three different protein bands in isoelectric focusing in the pH range from 4.0 to 4.5. The indirectly calculated content of carbohydrates was about 15%.

This TBG preparation was used for immunization of rabbits and for labelling with¹²⁵iodide by the chloramine T-method. The inter assay precision of the radioimmunoassay was satisfactory, the coefficient of variation being 4.3%. Serum dilution curves were found to be on the standard curve, proving no immunological heterogeneity, also in samples from subjects with quantitative TBG-variations.

The normal range of TBG levels (23.0±4.0 mg/l,x±SD) was shown to be in good agreement with the literature. But there existed a significant age dependency: The high TBG levels in the neonatal period were found to decrease until the age of 15 years remaining at this low level up to 50 years. Thereafter they increased continously. After the neonatal period there was a significant correlation between total T₄ and TBG levels in serum. Consequently the T₄/TBG ratio remained constant (3.2±0.7,x±SD), eliminating the age dependency of both, T₄ and TBG for diagnostic purposes.

There existed no sex differences in any period of life and no fluctuations during menstrual cycle. The estrogen induced rise of TBG levels could be confirmed quantitatively in females (pregnancy and estrogen therapy), similarly in males TBG increase could be demonstrated during fosfestrol therapy. In drug induced states of estrogen deficiency inversely a decrease of TBG levels could be shown in females during danazol therapy. These estrogen influences on TBG seem to be long term effects.

Variations of TBG levels in primary thyroid disorders reported in the literature could not be confirmed by the direct radioimmunological measurement: In hyperthyroidism (20.0±3.5 mg/l), endemic goiter (21.1±4.6 mg/l) and hypothyroidism (21.6±7.0 mg/l) TBG was essentially in the normal range. In these states of thyroid disorders the variations of T₄/TBG ratio are caused by variations of T₄-levels, whereas T₄/TBG ratio was found to be normal in states of TBG excess or TBG deficiency. Consequently this T₄/TBG ratio was elevated only in hyperthyroidism and decreased only in hypothyroidism.

Zusammenfassung

Zum Aufbau einer spezifischen radioimmunologischen Bestimmungsmethode von Thyroxin-bindendem Globulin (TBG) im Serum wurde eine reine TBG-Präparation hergestellt. Die erste Anreicherung des TBG aus humanem Poolplasma um den Faktor 640 wurde mit einer Affinitätschromatographie über Sepharose 4-B erreicht, an die Trijodthyronin (T₃) kovalent gebunden war. Die weitere Reinigung mit einer Gesamtanreicherung um einen Faktor von 4500 erfolgte über Anionenchromatographie (QAE- und DEAE-Sephadex A-50) und Affinitätschromatographie mit Concanavalin A (ConA-Sepharose). Die Wiederfindung von TBG über alle Schritte lag bei 20%. Das isolierte TBG, das in der Disc-Elektrophorese in drei verschiedenen Polyacrylamidkonzentrationen bei zwei verschiedenen pH-Werten (pH 7,0 und pH 8,9) als eine homogene Bande zur Darstellung kam, band Thyroxin (T₄) oder Trijodthyronin (T₃) äquimolar. Als Zeichen einer „Mikroheterogenität“ kamen beim isoelectric focusing im pH-Bereich von 4,0–4,5 drei Banden zur Darstellung. Der indirekt ermittelte Zuckeranteil der TBG-Präparation betrug 15%.

Diese TBG-Präparation wurde zur Immunisierung von Kaninchen und zur¹²⁵Jod-Markierung mit der Chloramin-T-Methode benutzt. Die Präzision des Radioimmunoassay von TBG von Tag zu Tag war mit einem Variationskoeffizienten von 4,3% gut. Die Verdünnungskurven aller bisher geprüften Serumproben — auch bei quantitativen TBG-Varianten — lagen auf der Kalibrierstandardkurve: Hinweise auf eine immunologische Heterogenität des TBG ergaben sich damit nicht.

Bei Kontrollpersonen mit einem mittleren TBG-Spiegel von 23,0±4,0 mg/l (x±s) zeigte sich eine zweigipflige Altersabhängigkeit der TBG-Konzentrationen im Serum: In den ersten vier postnatalen Lebenswochen fanden sich die höchsten TBG-Spiegel, die bis zum generationsfähigen Alter abfielen, um jenseits des 50. Lebensjahres wieder anzusteigen. Nach Abschluß der Perinatalphase bestand eine signifikante Korrelation zwischen dem Gesamt-T₄ und TBG. Der T₄/TBG-Quotient war altersunabhängig konstant (3,2±0,7;x±s) und folglich der geeignete diagnostische Parameter.

Ein Geschlechtsunterschied der TBG-Spiegel fand sich in keinem Lebensalter, ebenso konnten keine zyklischen Schwankungen bei Frauen im generationsfähigen Alter nachgewiesen werden. Der bekannte Anstieg der TBG-Spiegel unter Oestrogeneinfluß konnte bei Frauen (Antiovulantien und Gravidität) und bei Männern (Fosfestrol) quantitativ bestätigt werden. Umgekehrt konnte ein Abfall der TBG-Spiegel bei therapeutisch induziertem Oestrogenmangel (Danazol) erstmals aufgezeigt werden.

Bei primären Schilddrüsenfunktionsstörungen fanden sich keine signifikanten Änderungen der TBG-Spiegel, auch nicht bei direktem Vergleich zwischen Hyperthyreose (20,0±3,5 mg/l) und Hypothyreose (21,6±7,0 mg/l). Veränderte T₄/TBG-Quotienten spiegeln bei diesen Erkrankungen folglich die von der Norm abweichende Schilddrüsenfunktion wider. Von diesen Schilddrüsenfunktionsstörungen lassen sich an Hand der normalen T₄/TBG-Quotienten alle Zustände mit erhöhten bzw. erniedrigten Gesamt-T₄-Spiegeln abgrenzen, die primär auf einer quantitativen Änderung der TBG-Spiegel beruhen.