Histochemische Beobachtungen über das Violaquercitrin an bunten Rassen von Viola tricolor

Zusammenfassung

Es wurde das Auftreten und die Verteilung von Violaquercitrin in den Blütenblättern bunter Rassen vonViola tricolor histochemisch untersucht und dabei festgestellt:

• 1. Violaquercitrin kommt ausschließlich in gelben oder elfenbeinfarbigen Blütenblättern bunter Violarassen vor, und zwar stets gelöst im Zellsaft. Es fehlt in den rein weißen Stellen der Korollblätter, ebenso in den durch Anthokyan rötlich bis tiefdunkelblau gefärbten Partien.

• 2. Im Blütenblatt selbst ist es ausschließlich in den oberen papillösen Epithelzellen lokalisiert, was einerseits im unmittelbaren Auftreten von kristallisiertem Violaquercitrin in infiltrierten Blüten verfolgt wurde, anderseits durch Vergleiche von isolierten oberen und unteren Blütenblattepithelien bzw. reinem Schwammparenchym.

• 3. Auch ohne besondere Vorbehandlung fällt Violaquercitrin in infiltrierten Blütenblättern bei etwa 18° C nach etwa 12 bis 24 Stunden aus, und zwar in Form von mehr oder minder großen dendritischen Kristallaggregaten, die schon mit freiem Auge sichtbar sind und aus einzelnen mikroskopisch feinen Kristallnadeln bestehen.

• 4. Violaquercitrin kristallisiert stets erst während oder kurz nach dem Absterben der Zellen, und zwar gleichgültig, ob die Blütenblätter durch hohe oder tiefe Temperaturen oder tödlich wirkende Stoffe, vor allem starke Säuren, geschädigt werden.

• 5. Die chemische und kristalloptische Charakteristik wird an einzelnen Beobachtungen dargelegt, die in Übereinstimmung mit bereits vorliegenden chemischen Analysen, Löslichkeitsverhältnissen und Farbreaktionen stehen.

• 6. Neben Violaquercitrin wurde auch Violaxanthin beobachtet, dasin vivo an gelbe Chromatophoren gebunden ist, die beim Absterben desorganisiert werden und deren lipoide Anteile mit dem gelösten Violaxanthin zu Tropfen zusammenfließen.

• 7. Durch die Methode der Infiltration ganzer Blüten läßt sich auch binnen kurzem entscheiden, ob reinrassig weiße Formen vorliegen oder schwach gelbgefärbte, die im Gegensatz zu rein weißen dann Kristallbildung aufweisen.

Durch langsames Erwärmen infiltrierter lebender Blütenblätter auf etwa 60 bis 70° C läßt sich die sonst erst nach 12 bis 24 Stunden auftretende Kristallfällung so beschleunigen, daß man schon nach etwa 5 bis 10 Minuten Übersichtspräparate ganzer Blüten erhält, die auch mikroskopisch alle wünschenswerten Einzelheiten über das lokalisierte Auftreten, die Art und die Bedingungen der Kristallisation und vor allem die Verteilung des Violaquercitrins in verschieden bunt gefärbtenViola tricolor-Blüten erkennen lassen.

Summary (L)

The appearance and distribution of violaquercitrin, in flower petals of coloured races ofViola tricolor gave the occasion of a histochemical study which enabled to fix the following points:

• 1. Violaquercitrin is exclusively present in petals of yellow or ivory coloured flowers, and is dissolved in the cellular liquid. It is absent in the white spots of petals, as well as in the flower elements coloured in reddish or intensive dark blue by the anthocyane.

• 2. In the petals it is exclusively located even in the epithelial cells of the upper papillose. This was demonstrated firstly by the immediate apparition of cristallised violaquercitrin in flower infiltrates, and also by comparison with epithelium of petals isolated on the upper and on the reverse side and with the spongy penrenchyme.

• 3. In the absence of any preliminary special treatment, violaquercitrin precipitates in infiltrates of flower petals around 18° C after 12 to 24 hours. It forms cristalline aggregates, more ore less dendritic developed, already visible to the naked eye, and constituted of fine microscopical needles.

• 4. Violaquercitrin cristallises always only during or very little after the cell dies. It occurs as well if the petal is altered by application of high or low temperature as if by toxic substances like strong acids for instance.

• 5. The chemical and cristallographic characteristics were fixed and these confirm anterior analyses as well as solubility determinations and colour reactions.

• 6. Beside violaquercitrin, the existence of violaxanthine was observedin vivo, bound to the yellow chromatophores. At the moment of death, these are disorganised, their lipoidic parts assemble in little drops dissolving violaxanthine.

• 7. The infiltration method of whole flowers permits to proceed to a rapid distinction of the pure white races from those faintly coloured in yellow, the latter showing cristalline formations.

By slowly heating the living flower petals, infiltrated between 60° and 70°, cristals appear already after 5 or 10 minutes—whereas otherwise they only appear after 12 to 24 hours—; the preparations obtained in this way give all microscopic informations about localisation, way and conditions of cristallisation and above all the distribution of violaquercitrin in the coloured varieties ofviola tricolor flowers.

Macroscopic studies (except the observations ofKlein) are the only ones existing at present, although the chemical constitution of the violaquercitrin is accurately known. The author's researches confirm most of the reactions given byKlein and others about violaquercitrin^{7,8,9,10,11,12,13} located in microscopic preparations.

Concordance is perfect on every point except as regards the insolubility of violaquercitrin in baryum hydroxide “The flavone ofviola tricolor is insoluble with brown yellow colour in Ba(OH)₂” (Klein ⁴). On the contrary, the author found in her preparations a surprisingly easy solubility in baryum hydroxide.

The fact that this substance is precipitable with considerable speed as massive cristalline aggregates, excludes the possibility of a chemical scission as well as the existence of a scission product of violaquercitrin.

Furtherly, it is shown that ivory races also give cristals of violaquercitrin, whereas the white ones never do so. This leads to a rapid and easy check of the purity of the race.

It is remarkable that all flower parts containing anthocyan always are free from any trace of violaquercitrin. In relation to the known fact that anthocyanes (as glucosides) proceed from a sugar (E. Overton) it is explained that the flower elements where anthocyanes are found, can not stock violaquercitrin.

The attention is also drawn on the fact that beside violaquercitrin dissolved in the cellular liquid of the upper epithelium yellow races also contain some violaxanthine, whichKuhn andWinterstein have analysed.

This dye-stuff is boundin vivo to the chromatophores of the upper and inferior epiderm, whereas violaquercitrin always appears dissolved in the cellular liquid. The living chromatophores have irregular sizes and are intensively coloured in yellow.

The possibility of obtaining easily durable preparations by this technic is pointed out. The infiltrated flower petals containing abundant cristallisations are for this purpose transported into gelatine glycerine. The experiment succeeds as well with separated petals as with whole flowers, which after decolouring of the anthocyanin spots still show the colour pattern of theviola tricolor races. These patterns recall the macroscopic reactions of albuminoids on whole leaves, as shown byMolisch ¹⁶, or the starch test in an assimilating leaf.

Résumé (L)

L'apparition et la répartition du violaquercitrin, dans les pétales de fleurs des races bariolées deViola tricolor a fait l'objet d'une étude histochimique qui a permis de fixer les points suivants:

• 1° Le violaquercitrin se présente exclusivement dans les pétales des fleurs de couleur jaune ou ivoire et dissous dans le liquide cellulaire. Il manque dans les plages blanches des pétales, de même que dans les éléments de fleurs colorés en rougeâtre ou en bleu foncé intense par les anthocyanes.

• 2° Il est localisé dans le pétale même exclusivement dans les cellules épithéliales formant les papilles supérieures, ce qui fut démontré d'une part par l'apparition immédiate de violaquercitrin cristallisé dans des infiltrats de fleurs, d'autre part à la suite de la comparaison d'épithélium de pétales isolé à la face supérieure et inférieure ou du parenchyme spongieux.

• 3° Sans traitement spécial préliminaire, le violaquercitrin précipited ans les infiltrats de pétales de fleurs exécutés vers 18° C., et après un temps de 12 à 24 heures, sous la forme d'agrégats cristallins dendritiques plus ou moins grands, visibles déjà à l'œil nu et constitués par quelques fines aiguilles microscopiques.

• 4° Le violaquercitrin cristallise déjà pendant ou bien peu de temps après la mort de la cellule, et ce aussi bien si le pétale est endommagé par température basse ou élevée, ou par des substances toxiques, telles en particulier les acides forts.

• 5° Les caractéristiques chimiques et cristallographiques ont été fixées, elles concordent avec des analyses chimiques déjà faites antérieurement, déterminations de solubilité et réactions colorées.

• 6° A côté du violaquercitrin, l'existence de violaxanthine fut observéein vivo, laquelle est liée aux chromatophores jaunes. Lors de la mort, ceux-ci sont désorganisés, et la partie lipoïde de leur constitution se rassemble en gouttelettes avec la violaxanthine dissoute.

• 7° La méthode d'infiltration de fleurs entières permet de distinguer rapidement si l'on est en présence de races blanches pures ou bien de races faiblement jaunes, qui à l'encontre des races blanches pures donnent lieu à formations cristallines.

Par chauffage lent entre 60° et 70° les infiltrats de pétales de fleurs vivantes — qui ne précipitent des cristaux qu'après 12 ou 24 heures — donnent déjà après 5 ou 10 minutes sur des fleurs entières des préparations qui permettent au point de vue microscopique de trouver tous les renseignements, aussi bien sur la localisation, sur le mode et les conditions de cristallisation et avant tout la répartition du violaquercitrin dans les variétés bariolées de fleurs deViola tricolor.

Jusqu'à présent, sauf en ce qui concerne les observations deKlein ⁶ il n'existe que de sétudes macroscopiques, mais la constitution chimique de la substance est toutefois connue avec précision. A ce sujet les recherches ont confirmé la plupart des réactions du violaquercitrin données parKlein-et d'autres auteurs^{7,8,9,10,11,12,13} et localisé dans des préparations microscopiques.

Il y a concordance parfaite, sauf en ce qui concerne la démonstration deKlein relative à l'insolubilité du violaquercitrin dans l'hydroxyde de baryum «La flavone deViola tricolor est insoluble en jaune brun dans Ba(OH)₂» (Klein ⁴). Au contraire, j'ai trouvé dans mes préparations une solubilité facile, surprenante dans l'hydroxyde de baryum.

Le fait que cette substance est susceptible de précipiter très vite en gros agrégats cristallins, élimine la possibilité d'une scission chimique ainsi que celle de l'existence d'un produit de scission du violaquercitrin.

En plus des données connues à ce jour, on peut surtout démontrer que les races ivoires donnent lieu au violaquercitrin, tandis que les blanches n'en précipitent jamais. Ainsi peut on rapidement et facilement faire un contrôle de pureté de race par ce procédé.

Il est digne d'intérêt de signaler que tous les éléments renfermant des anthocyanines sont exempts de toute trace de violaquercitrin. A ce propos il est bien connu que la formation des anthocyanines (en tant que glucosides) est attribuée à un sucre (E. Overton ¹⁴), d'où l'on s'explique que les éléments des pétales de fleurs chargés d'anthocyanines ne peuvent mettre en réserve du violaquercitrin.

Il est en outre à remarquer qu'en dehors du violaquercitrin dissous dans le liquide cellulaire de l'épiderme supérieur de races jaunes deViola il y a encore de la violaxanthine, qui fut analysée parKuhn etWinterstein. ¹⁵ Ce colorant est liéin vivo aux chromatophores de l'épiderme supérieur et inférieur par opposition au violaquercitrin qui apparaît toujours comme dissous dans le liquide cellulaire. A l'état vivant les chromatophores sont de dimensions irrégulières et colorées en jaune intense.

Il est possible d'obtenir facilement des préparations durables selon une technique donnée. Il faut à cet effet transporter les pétales de fleurs infiltrées contenant d'abondantes cristallisations dans de la gélatine glycérine. Ce procédé réussit aussi bien dans le cas de pétales séparés que de fleurs entières, lesquelles après décoloration des plages chargées d'anthocyanines montrent encore le mode de bariolage des races deViola tricolor. Certaines figures rappellent les réactions d'albuminoïdes macroscopiques faites sur un feuillage tout entier, comme l'a montréMolisch ¹⁶ ou bien la mise en évidence de l'amidon dans une feuille assimilant.