New methodological criteria in rapid multichannel microspectrofluorometry

Summary

The application of microspectrofluorometric techniques to the study of various metabolic pathways in the dynamic context of intracellular interactions has gained further versatility through the use of better correlated microtopographic and spectral observations, rapid automatic data processing and a more accurate definition of specific conditions at fluorescence excitation and detection to minimize the action of exciting wavelengths on the stability of fluorochrome emission. The kinetic parameters of metabolic transients due to microinjection of substrate, are evaluated from 50–200 intracellular sites simultaneously at a temporal resolution of ~ 64 msec. Thus, regional asynchronicities and kinetic discrepancies of the metabolic response may be recognized in correlation with intracellular structure. Sequential changes in the topographic fluorescence pattern or in the fluorescence spectra may be used to define various intracellular pathways associated with the catabolism of natural metabolites or the intracellular distribution and conversion of exogenous molecules. The combination with automated data processing makes possible the uninterupted studies at the level of various intracellular compartments simultaneously on a topographic mode or the identification via spectral analysis of rapid intracellular conversion undergone by natural and exogenous fluorochromes.

Zusammenfassung

Die Anwendung spektralfluorometrischer Mikromethoden für das Studium verschiedener Stoffwechselvorgänge im dynamischen Zusammenhang intrazellulärer Reaktionen hat durch besser abgestimmte mikrotopographische und spektrale Beobachtungsmöglichkeiten, rasche automatische Datenermittlung, genauere Angabe spezifischer Bedingungen zur Fluoreszenzanregung und Herabsetzung der Einwirkung bestimmter Wellenlängen auf die Stabilität der Fluorochromemission zu weiteren Fortschritten geführt. Die kinetischen Parameter metabolischer Übergänge infolge einer Mikroinjektion von Substrat wurden gleichzeitig an 50–200 intrazellulären Orten mit einer zeitlichen Auflösung von etwa 64 msec ausgewertet. So können regionale Ungleichzeitigkeiten und kinetische Diskrepanzen der metabolischen Beantwortung in Korrelation zur intrazellulären Struktur erkannt werden. Aufeinander folgende Veränderungen der topographischen Fluoreszenzmuster oder der Fluoreszenzspektren lassen sich zur Definition verschiedener intrazellulärer Vorgänge beim Abbau natürlicher Metaboliten oder der intrazellulären Verteilung und Umsetzung exogener Moleküle verwenden. Die Kombination mit automatischer Datenverarbeitung ermöglicht ununterbrochene Untersuchungen in der Größenordnung verschiedener intrazellulärer Räume gleichzeitig auf topographischem Wege oder den spektralanalytischen Nachweis rascher intrazellulärer Umsetzungen natürlicher oder exogener Fluorochrome.