Bestimmung von Vitamin D in Lebensmitteln mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

Summary

A standardized method to determine the vitamin D content of food by means of HPLC is described. After the test material was homogenized and saponified with ethanolic aqueous potassium hydroxide solution, vitamin D was extracted usingn-hexane. Using HPLC on a silica gel column, the fraction containing vitamin D is separated from the nonsaponifiable residue. After the fraction was reduced, the residue was dissolved in methanol and the vitamin D content determined after HPLC separation on an RP-C₁₈ column. For evaluation, either a conventional external standard method using laboratory and matrix specific recovery rates as correction factors, or an internal standard method using vitamin D₂, and D₃, respectively as internal standards were employed. The method was developed and standardized by the working group “Vitamin Analysis” in accordance with § 35 LMBG (German Food Act). Repeatability and comparability of the results were checked in collaborative studies (14 laboratories) in milk powder and gruel that had been enriched with vitamin D₃. Applicability of the method to other food (eggs, milk, fish, margarine) was checked separately. The statistical evalution of the results of the collaborative studies has shown that the method is reliable enough to be included into the “Amtliche Sammlung” (official collection of analytical methods) according to § 35 LMBG. The present method may be used to determine the content of vitamin D₂ and D₃ in natural and vitaminized food. It is specific for the vitamins D₂ and D₃ released during saponification of food, but does not allow separate determination of the pre-vitamins D already present in the sample.

Zusammenfassung

Eine standardisierte Methode zur quantitativen Bestimmung von Vitamin D in Lebensmitteln mittels HPLC wird beschrieben. Nach dem Homogenisieren und Verseifen des Untersuchungsmaterials mit ethanolisch-wäßriger Kaliumhydroxid-Lösung wird Vitamin D mitn-Hexan extrahiert. Aus dem unverseifbaren Rückstand wird unter Anwendung der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf einer Silikagel-Säule (NP) eine das Vitamin D enthaltende Fraktion abgetrennt. Nach Einengen der Fraktion wird der Rückstand in Methanol gelöst und der Gehalt an Vitamin D nach HPLC-Trennung auf einer RP-C₁₈-Säule mittels UV-Detektor bestimmt. Die Auswertung erfolgt konventionsgemäß nach der externen Standardmethode unter Verwendung laborinternen und matrixspezifischen Wiederfindungsraten als Korrekturfaktoren oder nach der internen Standardmethode unter Verwendung von Vitamin D₂ bzw. D₃ als internem Standard. Das Analysenverfahren wurde im Rahmen des § 35 LMBG von der Arbeitsgruppe „Vitaminanalytik“ ausgearbeitet, standardisiert und die Wiederholbarkeit sowie Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse in Ringversuchen (14 Teilnehmer) an mit Vitamin D₃ angereichertem Milchpulver und Haferschleim überprüft. Die Anwendbarkeit der Methode für die Untersuchung von anderen Lebensmitteln (Eier, Milch, Fisch und Margarine) wurde außerhalb des Ringversuches in einem Labor untersucht. Die statistische Auswertung der Ergebnisse der Ringversuche ergab einen genügend hohen Grad an Zuverlässigkeit, um die Methode für die Aufnahme in die „Amtliche Sammlung“ nach § 35 LMBG zu empfehlen. Das vorliegende Analysenverfahren ist für die quantitative Bestimmung von Vitamin D₂ und D₃ in natürlichen und vitaminierten Lebensmitteln anwendbar. Es erfaßt die bei der Verseifung von Lebensmitteln freigesetzten Vitamine D₂ und D₃. Eine separate Bestimmung der in der Analysenprobe bereits enthaltenen Prävitamine D ist mit der Methode nicht möglich.