Summary
Using an insoluble insulin complex, it was possible to demonstrate that antibodies to insulin produced in individual animals are directed towards different portions of the insulin molecule. Furthermore, using the antisera from two different inbred strains of guinea pigs and their F1 and F2 offspring, evidence is presented for the genetic control of combining site configurations of antibodies to insulin produced in guinea pigs. The importance of different portions of the insulin molecule to biological and immunological activity was investigated. The attachment of125I to insulin (reportedly to the tyrosines at positions 14 and/or 19 of the A chain) seems to impair both the biological and immunological activity of insulin. The distribution of antibody-bound and free125I-insulin was found to be different from the distribution of non-labeled insulin. Relatively pure125I-insulin was separated from non-labeled insulin by acrylamide gel electrophoresis, and was found to have markedly reduced immunological reactivity in the immune hemolysis inhibition assay. It was concluded that antibodies to insulin exist which cannot react with iodinated insulin. Furthermore, when tested in the rat adipose tissue assay, purified125I-insulin preparations had little or no biological activity. Conversely, mono-substituted fluorescein-labeled insulin (purified on acrylamide gel electrophoresis) appears to retain full immunological and biological competence. Fluorescein is thought to attach to the N-terminal phenylalanine of the B chain and/or to the N-terminal glycine of the A chain. It is concluded that these two residues contribute little to the biological and immunological integrity of insulin. Studies of this nature aid in elucidating the surface configuration of insulin, and thereby may contribute to an understanding of its tertiary structure.
Résumé
En utilisant un complexe insulinique insoluble il a été possible de démontrer que les anticorps pour l'insuline produits par les animaux considérés individuellement sont dirigés vers différentes parties de la molécule d'insuline. De plus en utilisant les antisérums de 2 souches pures différentes de cobayes et de leur descendance F1 et F2 on a pu montrer que les facteurs génétiques contrôlent la configuration des sites de combinaison des anticorps anti-insuline produits par les cobayes. L'importance de différentes parties de la molécule d'insuline en ce qui concerne l'activité biologique et immunologique a été étudiée. La fixation de125I à l'insuline (que l'on a rapporté s'effectuer sur les tyrosines en position 14 et/ou 19 de la chaîne A) semble diminuer à la fois l'activité biologique et immunologique de l'insuline. La répartition de l'insuline liée aux anticorps et libre a été trouvée différente pour l'insuline-125I et pour l'insuline non marquée. Une insuline-125I relativement pure a été séparée de l'insuline non marquée par électrophorése sur gel d'acrylamide et a présenté une activité immunologique nettement diminuée dans le dosage par inhibition de l'immune-hémolyse. Il a été conclu qu'il existe des anticorps anti-insuline qui ne peuvent pas réagir avec l'insuline iodée. En outre, les préparations d'insuline-I125 purifiée ont peu ou pas d'activité biologique quand on les teste par dosage sur le tissu adipeux de rat. Par contre, l'insuline mono-substituée marquée à la fluorescéine (purifiée par électrophorèse sur gel d'acrylamide) paraît conserver tout son pouvoir immunologique et biologique. On pense que la fluorescéine se fixe à la phénylalanine N-terminale de la chaîne B et/ou à la glycine N-terminale de la chaîne A. On conclut que ces 2 résidus contribuent peu à l'intégrité biologique et immunologique de l'insuline. Des études de ce genre aident à élucider la configuration de surface de l'insuline, et par conséquent peuvent contribuer à comprendre sa structure tertiaire.
Zusammenfassung
Unter Verwendung eines unlöslichen Insulinkomplexes konnte gezeigt werden, daß die von einem Tier gebildeten Insulinantikörper gegen verschiedene Teile des Insulinmoleküls gerichtet sind. Weiter wurde unter Verwendung von Antiseren zweier verschiedener Inzuchtsstämme von Meerschweinchen und ihrer F1 und F2-Nachkommen der Nachweis für die genetische Steuerung der Konfiguration der Bindungsstellen der bei Meerschweinchen gebildeten Antikörper geführt. Es wurde die Bedeutung der verschiedenen Anteile des Insulinmoleküls für die biologische und immunologische Aktivität untersucht. Das Anheften von125I an das Insulinmolekül (anderen Arbeiten zufolge an das Tyrosin in Stellung 14 und/oder 19 der A-Kette) scheint die biologische und immunologische Aktivität des Insulins zu verändern. Die Verteilung von antikörpergebundenem und freiem125I-Insulin unterschied sich von der Verteilung des nichtmarkierten Insulins. Relativ reines125I-Insulin, das mit der Acrylamid-Gel-Elektrophorese von nichtmarkiertem Insulin getrennt wurde, zeigte im immunologischen Hämolysehemmtest deutlich herabgesetzte immunologische Aktivität. Es wurde angenommen, daß es Insulinantikörper gibt, die nicht mit Jodinsulin reagieren können. Außerdem hatte gereinigtes125I-Insulin wenig oder gar keine biologische Aktivität bei der Bestimmung mit der Methode mit Rattenfettgewebe. Im Gegensatz dazu scheint monosubstituiertes fluorescin-markiertes Insulin, (gereinigt mit der Acrylamid-Gel-Elektrophorese) die volle immunologische und biologische Wirkung zu behalten. Es wird angenommen, daß Fluorescin an das N des endständigen Phenylalanins der B-Kette und/oder an das N des endständigen Glycins der A-Kette angelagert wird. Es wird geschlossen, daß diese beiden Reste wenig für die biologische oder immunologische Integrität des Insulins ausmachen. Untersuchungen dieser Art tragen dazu bei, die Oberflächenkonfiguration des Insulinmoleküls aufzuklären und können dadurch einen Beitrag zur Kenntnis seiner Tertiärstruktur liefern.
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This study was supported by United States Public Health Service Grant AM 06001.
This paper is based on a talk given before the British Insulin Manufacturers' Colloquium on “The Immunology of Insulin” on September 16, 1965.
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Arquilla, E.R., Ooms, H. & Finn, J. Genetic differences of combining sites of insulin antibodies and importance of C-terminal portion of the A chain to biological and immunological activity of insulin. Diabetologia 2, 1–13 (1966). https://doi.org/10.1007/BF01106969
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DOI: https://doi.org/10.1007/BF01106969