Isoenzymes of wheat o-diphenolase revealed by column isoelectric focusing

Zusammenfassung

Weichweizen-o-Diphenoloxydasen verschiedener Reinigungsstufen wurden über eine Säule isoelektrisch focussiert. Das durch Calciumphosphatgel gereinigte Enzym (Fraktion C) zeigt 4 multiple Formen, focussiert bei pI 3,60; 4,65; 6,80 und 9,60. Die Aktivität und der Reinheitszustand von diesen vier Formen wurden berechnet. Die Fraktion C wurde durch Chromatographie über Cellulose weiter gereinigt. Die in größeren Mengen gewonnene Fraktion zeigte beim isoelektrischen Focussieren keine multiple Formen mehr, nur eine Trennung von enzymatisch inaktiven Proteinen beim pH-Gradienten. Das enzymatisch aktive Protein, focussiert bei pI 9,60, zeigte einen 1753 mal besseren Reinheitszustand als das Rohenzym. Die Anwendung dieser Technik erlaubt die Charakterisierung der Weichweizen-o-Diphenoloxydasen und ihre Gewinnung in einem hochgereinigten Zustand.

Summary

Common wheat o-diphenolase at different purification steps has been submitted to column isoelectric focusing electrophoresis. The fraction purified with calcium phosphate gel shows multiple forms focused at pI 3.60, 4.95, 6.80, and 9.60. The enzyme activity and the purification degree of the four enzymatic components obtained have been calculated. The major fraction recovered after purification by chromatography on DEAE-cellulose does not display other multiple forms; however, it has some enzymatically inactive proteins well separated in the pH-gradient. The enzymatic protein, focused at pI 9.60, thus achieves a 1753-fold purification over the crude extract. The application of the technique allows a characterization of the wheat o-diphenolase and its recovery in highly purified form.