Cleavage of thiamine pyrophosphate by sulfite in saccharomyces cerevisiae

Zusammenfassung

Zur Spaltung von Thiamin in vitro genügen geringe Sulfitkonzentrationen (≧1 mM). Das Ausmaß der Spaltung hängt ab von der Zeit, der Temperatur und vom pH-Wert. Gespalten werden auch Thiaminmonophosphat (TMP) und Thiaminpyrophosphat (TPP), wenn auch mit geringerer Reaktionsgeschwindigkeit. Zur Trennung and Bestimmung des Thiamins and seiner Phosphatester in Hefe wurde eine HPLC-Methode angewandt. Thiamin, TMP and TPP wurden durch alkalische Oxidation in die entsprechenden fluorescierenden Thiochromderivate umgewandelt, dann an einer HPLC-Saule mit Aminophase adsorbiert und mit Acetonitril/100 mM-Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 (40+60, v/v) als Laufmittel eluiert. In Hefe lagen 73 % der Summe aller Thiaminverbindungen als TPP, 26% als Thiamin und 1% als TMP vor. Im Verlauf von Langzeitinkubationen (bis zu 24 Stunden) von Hefezellen mit 2 mm-Sulfit verringerte sich deren Gehalt an TPP und auch an ATP stark, und zwar in Abhängigkeit vom pH-Wert des Mediums. Der Verlust an ATP erfolgte rascher und in größerem Umfang als der Verlust an TPP. Durch Sulfit wurde die Aktivitat zweier von TPP als Cofaktor abhängiger Enzyme, der Pyruvatdecarboxylase [EC.4.1.1.1] und der Transketolase [EC.2.2.1.1] auf 58% bzw. 13% reduziert.

Summary

Sulfite at low concentrations (≧ 1 mM caused a cleavage of thiamine in vitro depending upon time, pH value, and temperature. Thiamine monophosphate (TMP) and thiamine pyrophosphate (TPP) were also cleaved, but the reaction rates were slower. For the separation and determination of thiamine, TMP and TPP in yeast high-performance liquid chromatography (HPLC) was used. Thiamine and its phosphate esters were converted into the corresponding fluorescent thiochrome derivatives by alkaline oxidation, adsorbed on an amino-phase HPLC column and eluted with acetonitrile/100 mM-potassium phosphate buffer, pH 7.5 (40+60, v/v) as solvent system. In yeast TPP represented about 73% of the sum of all thiamine compounds, thiamine and TMP 26% and 1%, respectively. During long-term incubations of yeast (up to 24 hours) 2 mM-sulfite decreased the intracellular content of TPP and also of ATP depending upon the pH value of the medium. The decreasing effect of sulfite on the ATP content was faster and stronger than on the TPP content. Two TPP-dependent enzymes, pyruvate decarboxylase [EC.4.1.1.1] and transketolase [EC.2.2.1.1] were inactivated by sulfite within 1 hour to 58% and 13% of the initial values, respectively.