Morphologische und biochemische Charakterisierung der Entwicklung befruchteter Eier des SeeigelsSphaerechinus granularis Lam

Summary

The investigations were performed with the eggs of the sea urchin speciesSphaerechinus granularis Lam. They were kept at 22° C under continuous aeration for up to 45 hours with stirring to compensate for sedimentation. 1. The change in DNA content, 2. the change in DNA dependent DNA polymerase activity, and 3. the change in DNase activity with time have been evaluated.

• 1. DNA Content of Embryos. The DNA content of the embryo development was determined by two different methods. Before and immediately after fertilization DNA content has been found to be 1.7±0.5·10⁻¹⁰ g per egg. This amount is about 100 times higher than in diploid nuclei. Three periods with different rates of DNA synthesis may be distinguished: a) the first one, lasting from fertilization to about the time of the volume maximum just before the onset of gastrulation with an average rate of synthesis of 1.2·10⁻¹⁰g DNA per minute per embryo; b) a second one, lasting from then on to the gastrula stage with a lower average rate of synthesis of about 0.7·10⁻¹² g DNA per minute per embryo; c) a third one, starting from the gastrula stage up to the experimental end point in the pluteus stage. The rate of synthesis in this case is 2.3·10⁻¹² g DNA per minute per embryo. On a relative base the rates of synthesis are 100∶58∶192. The cytoplasmic, extramitochondrial DNA persists through the stage of the first period of the embryogenesis, up to the blastula stage. The amount of extranuclear DNA increases in the first 6 hours of embryo development; then the cytoplasmic DNA disappears.

• 2. DNA Dependent DNA Polymerase Activity. The DNA polymerase has been isolated from embryos. Its activity has been determined in relation to the activity of the total embryo as well as per embryonic cell. The polymerase activity is much higher at the start of the development than in later stages, reaching a minimum in the blastula stage, the time at which cytoplasmic DNA has been exhausted. In the subsequent period the polymerase activity parallels the rate of DNA synthesis in vivo. The level of the DNA polymerase activity per cell remains constant.

• 3. DNase Activity. The DNase activity has been determined using the Lanthanum-Nitrate-Method. Three distinct maxima were found: A first maximum is reached immediately upon fertilization. The second one coincides with the onset of mesenchyme formation in the blastula, and the third one coincides with the end of gastrulation. The average specific activity is roughly equivalent to about 10⁻⁶ g DNase I per g of embryo. The possibility is discussed that rises in nucleolytic activities may trigger differentiation events in the developing egg.

The influence of DNA polymerase activity and DNase activity on in vivo DNA synthesis is discussed.

Zusammenfassung

Die Untersuchungen wurden mit Eiern und Embryonen des Seeigels Sphaerechinus granularis Lam. durchgeführt, die bei 22° C unter sedimentationsverhinderndem Rühren und Belüftung bis zu 45 Std gehalten wurde. Die Änderung des DNA-Gehaltes, die Änderung der DNA-Polymerase Aktivitäten und die Änderung der DNase-Aktivitäten wurden als zeitabhängige Geschehnisse untersucht.

• 1. DNA-Gehalt der Embryonen. In den Embryonen wurde der DNA-Gehalt mit zwei verschiedenen Methoden bestimmt. Vor und unmittelbar nach der Befruchtung wurden DNA-Gehalte von 1,7±0,5·10⁻¹⁰ g pro Ei gefunden. Diese DNA-Menge entspricht dem 100fachen des diploiden Zellkernes. Drei Perioden unterschiedlicher DNA Syntheseraten können herausgestellt werden: Eine erste, die etwa mit dem Volumenmaximum im Blastula-Stadium erreicht ist, mit einer mittleren Synthesegeschwindigkeit von 1,2·10⁻² g DNA pro Minute pro Embryo; eine zweite Periode, von dem vorherigen Punkt bis zum Erreichen des Gastrula-Stadiums, zeigt eine geringere Synthesegeschwindigkeit als die im ersten Abschnitt ablaufende, mit ca. 0,7·10⁻¹² g DNA pro Minute pro Embryo; dieser folgt eine dritte, bis zum Ende der von uns gewählten Untersuchungsdauer im Pluteus-Stadium mit einer Synthese-geschwindigkeit von 2,3·10⁻¹² g DNA pro Minute pro Embryo. Die relativen Synthesegeschwindigkeiten verhalten sich wie 100∶58∶192. Die cytoplasmatische, extramitochondriale DNA bleibt während der Anfangsphase der Entwicklung bis zum Blastula-Stadium erhalten. Die extranucleäre DNA nimmt in den ersten 6 Std der Entwicklung des Embryos sogar noch zu, um anschließend zu verschwinden.

• 2. DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität. Die DNA-Polymerase wurde aus den Embryonen isoliert, ihre Aktivität bestimmt und auf einen Embryo bzw. eine Zelle bezogen. Dabei war die Polymerase-Aktivität zu Beginn der Embryogenese wesentlich höher als in späteren Entwieklungsstadien. Die Polymerase-Aktivität durchläuft während des Blastula-Stadiums ein Minimum zu dem Zeitpunkt, an dem die cytoplasmatische DNA in den Embryonen aufgebraucht ist. In der anschließenden Entwicklungsphase ist die Höhe der DNA Polymerase-Aktivität proportional der DNA Syntheserate in vivo; dabei bleibt der Wert für die DNA Polymerase-Aktivität pro Zelle konstant.

• 3. DNA-abbauende Aktivität. Die DNase Aktivität im alkalischen Bereich wurde mit der Lanthan-Nitrat-Methode bestimmt, wobei sich drei sehr deutliche Maxima zeigen. Das erste Maximum findet sich unmittelbar nach der Bespermung, das zweite fällt mit der Mesenchymbildung während der Blastula zusammen und das dritte korrespondiert mit dem Ende der Gastrulation. Die durchschnittliche spezifische Aktivität ergibt sich zu etwa 10⁻⁶ g DNase I Äquivalent/g Embryo. Die Möglichkeiten, ob die Aktivitätsmaxima dieser nucleolytischen Enzyme jeweils Differenzierungsvorgänge in den Keimen einleiten, werden diskutiert.

Abschließend wird der Einfluß der in vitro bestimmten DNA-Polymerase-Aktivität und der DNase-Aktivität auf die in vivo ablaufende DNA-Syntheserate diskutiert.