Quantitative Proteinbestimmung in Einzelzellen mit Amidschwarz

Summary

In aqueous solution Amido Black B (ASB) forms stable and well-defined complexes with bovine serum albumin (RSA) at pH 5.5. The complexes can be separated by column chromatography. The formation of the complexes consists in a fast reaction during which, after 3 to 5 h approximately, 3 molecules of ASB have been bound per molecule RSA, and of a much slower reaction which, even after a laps of 24 h, is still far from approaching its final stage. With solid films of RSA, after denaturation with ethanol, fast reaction is found to approach its final stage after 10 min reaction time. With these model protein preparations, the molar extinction coefficient of the ASB-protein complexes can be determined: the soluble ASB-RSA complexes can be brought to complete dissociation at pH 12.3. After the additivity of the specific absorptions of both RSA and ASB had been proven, it was possible to determine the content of the solution of ASB and RSA, and therefrom the molar extinction coefficient of the ASB-RSA-complex at pH 5.5: ε₆₂₀=110,000. ASB-stained ethanolfixed RSA films show an ε₆₂₀ of approximately 96,000, if their thickness and specific weight are known.

After incubation in watery or ethanolic/TCA solutions of ASB, also animal cells fixed with ether-ethanol show the ASB absorption band to be in the region of 600 nm after removal of the surplus of ASB by thorough washings. As already observed with the RSA films, the kinetics of the staining of the cells show the fast reaction reaching its final stage already after 15 to 20 min. When alcoholic solution of ASB is used, the extinctions are found to be twice or three times higher than those achieved by an aqueous one. After standardization of the staining procedures with both solvents the total extinctions of EATZ, YATZ, rat hepatocytes, chicken thymus and bursa cells were measured and plotted against the macroscopically determined protein content of the respective cells. Highly significant positive linear correlations resulted with staining both in watery and alcoholic solutions, respectively. From the slope of the straight lines, the specific extinction coefficient of ASB stained cellular proteins could be calculated up to ε′₆₂₀=1.76 with watery ASB solution and ε′₆₂₀=3.83 with the alcoholic solvent. The soluble ASB-RSA complexes have an ε′₆₂₀=1.67 the ASB stained ethanol denaturated films of RSA an ε′₆₂₀ of within a range of 1.21 to 1.80.

Zusammenfassung

Amidschwarz B (ASB) bildet in wässriger Lösung bei pH 5,5 mit Rinderserum-Albumin (RSA) stabile und definierte Komplexe, die säulenchromatographisch isoliert werden können. Die Reaktion gehorcht einer komplexen Kinetik und besteht im wesentlichen aus einer schnellen Reaktion, bei der nach etwa vier Stunden drei Moleküle ASB pro Mol RSA gebunden sind und einer wesentlich langsamer verlaufenden, die auch nach 24 h noch gegen keinen Grenzwert konvergiert. Mit Äther/Äthanol denaturierte Filme von ASB zeigen dagegen nur die schnelle Reaktion, die hier jedoch bereits nach zehn Minuten den Grenzwert erreicht hat. Der molare dekadische Extinktionskoeffizient des ASB-RSA-Komplexes läßt sich an diesen Proteinmodellen bestimmen: die säulenchromatographisch isolierten Komplexe haben ihr längstwellings Absorptionsmaximum bei 620 nm und können bei pH 12,3 dissoziiert werden. Nachdem die Additivität der Einzlabsorptionen von ASB und RSA bewiesen werden konnte, ist es möglich, aus den Gesamtspektren sowohl den Protein-, als auch den ASB-Gehalt und daraus den Extinktionskoeffizienten, des bei pH 5,5 gebildeten Protein-ASB-Komplexes, zu ermitteln. Er beträgt nach 3–5stündiger Reaktionszeit rund 110000.

Auch bei den denaturierten RSA-Filmen kann, bei bekannter Filmdicke und Dichte, der Extinktionskoeffizient der ASB-Bande bei 620 nm in guter Nährung zu rund 96000 bestimmt werden.

Mit Äther-Alkohol fixierte tierische Zellen zeigen ebenfalls nach Einwirkung von ASB und Auswaschen des überschüssigen Farbstoffes das Absorptionsmaximum im Bereich von 600 nm; als Lösungsmittel für den Farbstoff werden Wasser pH 5,5, bzw. Äthanol-TCA mit 200 mg, bzw. mit 150 mg pro 100 ml verwendet. Mit beiden Farbstofflösungen zeigt die Zeitabhängigkeit der Färbung, in Analogie zu den fixierten RSA-Filmen, nur die schnelle Reaktion, die ebenfalls nach 15–20 min bereits den Endwert erreicht. Dieser liegt bei Verwendung der alkoholischen Lösung zwei- bis dreimal höher, als bei Verwendung der wässrigen Lösung. Nach Optimierung der Färbung mit beiden Lösungsmitteln werden die Gesamtextinktionen von EATZ, YATZ, Ratten-Hepatocyten, Hühner-Thymus-und-Bursazellen gemessen und gegen die makroskopisch nach Lowry bestimmten Gesamtproteingehalte [mg/10⁶ Zellen] aufgetragen. Dabei ergeben sich für die Färbung in beiden Lösungsmitteln hochsignifikante positive Linearkorrelationen. Aus der Steigung der Ausgleichsgeraden errechnet sich der spezielle dekadische Extinktionskoeffizient ɛ′[g⁻¹·1000 cm²] für die mit ASB gefärbten Zellproteine zu 1,76 (wässrige Lösung) und 3,83 (äthanolische Lösung). Bei den in wässriger ASB-Lösung gefärbten RSA-Filmen ergibt sich aus den molaren Extinktionskoeffizienten ɛ ein Konfidenzbereich für den speziellen ɛ′ von 1,21 bis 1,80, beim molekular gelösten RSA ein ɛ′ von 1,67.